土霉素提取实验.docxVIP

一、实验目的 1、了解和掌握发酵产物的分离提取流程。 2、熟悉和掌握等电点法结晶的原理与方法。 3、熟悉和掌握树脂脱色的原理和操作技术。 4、掌握常用的比色分析方法的操作技术。 5、掌握土霉素提取总收率的计算过程 二、实验原理目前工业生产上主要采用等电点沉淀法。其原理是利用土霉素具有两性化合物的性质，在其等电点时溶解度最小，从水溶液中结晶出来，以直接获取土霉素碱产品。现在，工业上土霉素提炼工艺的具体过程是：1、酸化(1)酸化过程采用草酸酸化，使菌丝中的土霉素释放出来并生成溶于水的盐，并且能析出草酸钙沉淀，从而去除发酵液中的钙离子，同时草酸钙能促进蛋白质的凝结，从而提高滤液的质量。另外，草酸属于弱酸，其对设备的腐蚀性要比盐酸、硫酸小。(2)pH的控制：加入草酸的目的是释放菌丝中的单位，同时要保证土霉素的稳定性、成品的质量和提炼成本。目前，工业提炼的pH控制在1.6～2.0范围内，pH值过高对单位的释放不利，pH值过低会影响产品的质量，同时会增加产品的成本。(3)发酵液的去杂：发酵中存在着许多有机和无机的物质，加入净化剂黄血盐和硫酸锌除去铁离子和蛋白质。去杂过程采用的净化剂是黄血盐和硫酸锌，利用二者的协同效应除去蛋白质，同时除去铁离子。 2、稀释：将发酵液进行适当的稀释，一般稀释2～3倍，有利于过滤脱色过程。3、过滤：发酵液经过预处理后可用板框过滤机或真空抽滤瓶进行过滤，实现固液分离。工业上采用低单位滤液和草酸水顶洗滤饼以提高收率。4、脱色：采用122#树脂对滤液进行脱色，其原理利用122#树脂为阳离子交换树脂，处理为氢型树脂后，所带的氢离子与色素蛋白质中的氮、氧形成氢键，对过滤液中的色素有吸附作用，进行脱色。要求脱色液在500nm下的透光率达85％以上。(使用721型分光光度计测定脱色液的透光率)。5、沉淀结晶：土霉素脱色液加入碱化剂调pH值到等电点附近，使土霉素从脱色液中直接沉淀出来。(1)碱化试剂的选择：碱化试剂一般有氢氧化钠、氨水、碳酸钠、亚硫酸钠。由于氢氧化钠碱性过强，单独使用会造成局部过碱，从而破坏土霉素，影响产品的质量，碳酸钠虽然有抗氧化性和脱色的作用，但是它的碱性较弱，调pH所用的量比较大，氨水的碱性比氢氧化钠弱比碳酸钠强，并且价格比较便宜，所以氨水是最好的碱化试剂。碱化过程中所用的氨水应当含有2％～3％的亚硫酸钠，这样既能调pH值，又能起稳定的作用，同时还能脱色。(2)pH值的控制：pH值的不同，对产品的质量和产量会造成不同的影响。土霉素的等电点是pH=5.4。在等电点附近沉淀结晶比较完全，并且收率也比较高，但杂质的含量比较高，会影响产品的色泽和质量。所以一般控制pH值在4.4～4.8的范围内。6、离心分离、干燥：经过沉淀结晶后，结晶液进入到离心机中，进行固液分离，离心后的晶体再经过正压干燥，即得到了土霉素碱产品。 化学法测定土霉素的效价是利用土霉素能和三氯化铁产生颜色反应，符合比耳定律的性质进行的。由于土霉素中的酚基和三氯化铁反应呈褐色，在480nm下，用分光光度计，测定吸光度值，可定量土霉素的含量。 仪器与材料使用的仪器： 使用的试剂：JJ200型精密电子天平 草酸酸度计 七水合硫酸铜气浴恒温振荡器 六水合三氯化铁81-2型恒温磁力搅拌器 黄血盐氯化钾 氨水AP-9901s真空泵 亚硫酸钠BT01-100型蠕动泵 浓盐酸722型分光光度计 硫代硫酸钠 土霉素碱标准品 122#树脂 三， 实验方法 1发酵液预处理1.1取少量发酵液，按前述发酵液效价的测定方法测出其效价。1.2取一定体积发酵液，边搅拌，边加入黄血盐0.35％、硫酸锌0.2％，并加入草酸酸化发酵液pH至1.6～2.0，搅拌30分钟后，再将酸化液取出少许，按酸化液效价的测定方法测定其效价并计算酸化收率。2．过滤用量筒量取酸化稀释液（效价：19946u/mL）150mL，用真空抽滤瓶进行过滤，滤饼再用20mL草酸水冲洗，测出滤液的体积。测定其效价（留取1mL滤液放置在试管中待测：取其中的0.5mL，用草酸水稀释20倍，取1mL稀释液测效价）并计算过滤收率。3．脱色连接蠕动泵，控制走柱速度：2-2.5mL/min。注意树脂柱不要干柱。脱色时要注意前一段时间的脱色液不要收集，待其效价达到2000u／mL以上时再收集