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苹果EST—SSR引物开发和部分品种亲缘关系研究 　　摘 要： 【目的】开发苹果 EST-SSR 引物，评价苹果种质资源的多样性与亲缘关系。【方法】利用 NCBI数据库中苹果 EST 的 SSR 位点开发了 35 对 EST-SSR 引物，建立了苹果 EST-SSR 体系，并利用筛选出的 16 对引物对苹果品种资源的亲缘关系进行研究。【结果】118 份基因组 DNA 共扩增出等位基因位点 138 个，位点数的变化从 3 到 13 不等，平均每对引物检测到 8.62 个位点，总的多态性比率为94.2%，各引物的多态性比例分布为 81.8%～100%，相似系数为 0.48～1.00。利用 UPGMA 法构建聚类树状图，在相似性系数 0.65 处可将 118 个供试材料分为5大组：其中第1组又可分为2个亚组，包含了绝大部分供试材料；第2、3、4和5组包含的品种数目分别为 12 个、11 个、3 个和 2 个；第5组与其他组亲缘关系较远，相似性系数仅为 0.48。【结论】筛选出的 16 对 EST-SSR 引物可用于评价苹果种质资源间的遗传多样性。 关键词： 苹果； EST-SSR 引物； 亲缘关系； 聚类分析； 相似性系数 中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0509-07 苹果属（Malus Mill.）植物种类繁多，分布广泛，多具有较高的经济价值。之前，分类学家从形态学、细胞学、孢粉学、同工酶等方面对苹果的亲缘演化关系进行研究并取得一定进展[1-3]。但传统方法对于差异不明显的形态有时难以识别，一些特征易受生态环境的影响，SSR 标记多态性丰富、稳定性突出，在苹果及近缘种质鉴别与亲缘关系研究中也已得到应用[4-6]。但开发 SSR 标记过程繁琐，成本较高，是其应用的主要限制因素[7]。EST-SSR 标记具有开发效率高、成本低的特点，是 SSR 标记的重要来源[8]，因其来自基因编码区，更易获得基因表达的信息，目前已经应用在葡萄[9]、甘蔗[10]、小麦[11]、大麦[12]、大豆[13]、水稻[14]等物种的遗传多样性分析、遗传图谱构建和系统演化研究等领域。近年来，随着苹果属 EST 库数据资源不断丰富，开发 EST-SSR 标记已具备了基础，姚利华等[15]用开发出的12 对 EST-SSR 引物对 20 个苹果品种的多样性进行了检测，Gasic 等[16]对苹果EST-SSR 在其他蔷薇科植物上的应用进行了研究。我们拟利用数据库资源开发新的 EST-SSR 标记，对 118 份苹果种质进行亲缘关系分析，以丰富该类标记资源，并对育种中品种资源的评估、筛选与利用提供参考。 1 材料和方法 1.1 材料 1.2 方法 1.2.1 EST-SSR 序列的查找 利用 SSR 鉴定软件与网站在线搜索工具，从 GDR（http：//www.bioinfo.WSU.edu/gdr/）中搜索苹果属含有 SSR 的 EST 序列，并进行可利用性筛选，筛选序列长度不小于100 bp且不大于 700 bp 以及单至六碱基重复单元的重复次数至少为 10，6，5，5，5 和 5 的标准[9]。 1.2.2 EST-SSR 引物对的设计 应用引物设计软件 Primer Premier 5.0 对符合条件的部分 EST-SSR 序列进行引物设计。设计 EST-SSR 引物的原则和参数为：避免二级结构；引物长度一般控制在 18～22 bp；GC 含量在 40%～60%；理论退火温度 （Tm） 在 55～60 ℃ ，且上下游引物Tm 值相差不超过 5 ℃；产物长度控制在 100～350 bp，以更加有效地扩增目标 SSR。引物委托上海生物工程技术服务有限公司合成。 1.2.3 基因组 DNA 提取及检测 采用改良的 CTAB 法[17]提取苹果叶片总 DNA。获得的 DNA 经紫外分光光度计检测OD260/OD280 比值；用 0.8% 的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 纯度。将合格的基因组 DNA原液稀释到 20 mg·L-1 于-20 ℃ 条件下保存备用。 1.2.4 SSR-PCR 扩增 PCR 扩增在 PTC-200PCR 仪上进行。通过优化确定了稳定的苹果 EST-SSR 反应体系，即在 25 μL 体系中，MgCl2 浓度为 2.0 mmol·L-1，dNTPs 浓度为 0.3 mmol·L-1，TaqDNA聚合酶用量为 1.0 U，DNA 模板用量为 1.5 mg·L-1，引物浓度为0.4 μmol·L-1。扩增程序为： 94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性 45 s，52 ℃ 退火 45 s，72 ℃ 延伸1 min，进行30