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香菇液体培养过程中3种胞外酶酶活变化 　　摘要：研究了香菇[Lentinus edodes （Berk.） sing]808在液体培养时淀粉酶、羧甲基纤维素酶（CMC酶）、漆酶3种胞外酶酶活的变化，以及胞外蛋白质含量的变化。结果表明，淀粉酶酶活在培养第4天时出现高峰，CMC酶、漆酶酶活都在第13天达到最高值，说明香菇最先利用的物质是淀粉。胞外蛋白质含量的变化与总酶酶活变化基本相同。 关键词：香菇[Lentinus edodes （Berk.） sing]；淀粉酶；羧甲基纤维素酶；漆酶 中图分类号：S646.1+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）14-3391-03 香菇[Lentinus edodes （Berk.） Sing.]隶属于伞菌目，营养丰富，具有一定的药用价值[1]，且适应性强、栽培面积广。香菇生物降解木质纤维素及其他有机大分子是通过基质中的菌丝不断向胞外分泌各种酶来实现的，因此酶活的大小直接影响生物降解能力[2]，与香菇的产量密切相关。近年来有关香菇的品种选育、栽培及液体培养已有报道，但是尚未有香菇在液体培养条件下3种胞外酶酶活的研究报道。本研究重点探讨香菇液体培养时胞外酶的酶活，为营养生理研究以及香菇的高产栽培提供一定的理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供测菌种 808品种为浙江省主栽香菇品种。 1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，用去离子水补足至1 000 mL，pH自然，于121 ℃灭菌20 min。液体培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、MgSO4 1 g、KH2PO4 1 g、维生素B 0.02 g，pH自然，用去离子水定容至100 mL（用250 mL锥形瓶），于121 ℃灭菌20 min。 1.2 方法 1.2.1 菌种的活化 菌种活化以PDA培养基为基础培养基，在无菌条件下，用接种针从香菇菌种上切取1 cm2的菌块至活化培养基上[3]，于25 ℃培养箱中黑暗培养7～12 d，直至菌丝长满斜面，确定无污染且长势良好后作为供试菌种。 1.2.2 种子液的制备 向液体培养基中接入供试菌种，每支斜面试管接一瓶[4]，3次重复，封口标记后置于（25±1） ℃恒温摇床中，以100 r/min振荡培养8～12 d，即得种子液。 1.2.3 液体培养 将种子液的菌丝球匀浆后接入培养基中，按接种量10%接种至液体培养基中[5]，置于（25±1） ℃恒温摇床中以100 r/min振荡培养。 1.2.4 粗酶液的制备 定时观察，从第4天开始，每隔3 d吸取发酵液5 mL，于4 ℃下以4 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液，连续测定6次，最后一次制备酶液与前一次相隔2 d。 1.2.5 淀粉酶酶活的测定 取10 g/L可溶性淀粉溶液（用pH 4.6，0.1 mol/L醋酸缓冲液配制）1.2 mL、粗酶液0.8 mL，于40 ℃水浴中保温30 min，取出后立即加入2 mL DNS试剂，于沸水中显色10 min。冷却后加入去离子水定容，混匀，于520 nm[6]处测吸光度，以在沸水浴中煮沸灭活15 min的酶液为对照，设置3个平行，取平均值。1个酶活单位（1 U）定义为1 mL的发酵液在40 ℃下1 min生成0.1 mg还原糖的淀粉酶的量[7]。DNS试剂具体制备方法参照文献[5]。 1.2.6 羧甲基纤维素酶（CMC酶）酶活的测定 取5 g/L CMC-Na溶液（用pH 4.6，0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液配制）[5，8，9]1 mL、粗酶液1 mL，于50 ℃水浴中准确保温30 min，之后的操作方法与1.2.5同。 1.2.7 漆酶酶活的测定 采用ABTS法，具体参考文献[10，11]。3 mL酶活反应体系含1 nmol/L ABTS 0.5 mL、酶液0.5 mL和HOAc-NaOAc（pH 4.5）缓冲液2.0 mL。在反应的前3 min内在420 nm处测定吸光度的变化（每15 s记录一次）。以1 nmol/L ABTS 0.5 mL、HOAc-NaOAc（pH 4.5）缓冲液2.5 mL的混合液作为对照。 1.2.8 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝染色测定法[12]。具体操作如下：取去离子水0.9 mL、粗酶液0.1 mL、考马斯亮蓝染色液5 mL至试管中，混合均匀，于595 nm处测吸光度，以去离子水1 mL、考马斯亮蓝5 mL的混合液作为对照，设置3个平行试验，取平均值。作牛血清白蛋白标准曲线，得出蛋白质含量。 2 结果与分析 2.1 香菇液体培养过程中