产耐高温谷氨酰胺转胺酶菌株的快速筛选方法-生物通.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（８）：８３８９ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 技术与方法 檪 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 产耐高温谷氨酰胺转胺酶菌株的快速筛选方法 １ １ ２ ２ １ １ １ １ ３ 郭玮婷 　张　慧　查东风 　黄汉峰　黄　静 　高红亮　常忠义　金明飞 　鲁　伟 （１华东师范大学生命科学学院　上海　２００２４１　２河南省商丘市农业局经作中心　商丘　４７６０００） （３泰兴市东圣食品科技有限公司　泰兴　２２５４１１） 摘要　目的：采用亚硝基胍（ＮＴＧ）诱变结合９６孔板高通量筛选方法筛选产耐高温谷氨酰胺转胺酶 （ＭＴＧ）的茂原链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）。方法：通过优化９６孔板高通量测定ＭＴＧ活性的方 法、确定筛选温度和时间，建立了产耐高温ＭＴＧ菌株的快速筛选方法；通过优化ＮＴＧ诱变条件建立 了筛选突变库；通过９６孔板高通量初筛、摇瓶复筛获得了产耐高温ＭＴＧ的突变株１２８２，并通过摇 瓶发酵对１２８２所产ＭＴＧ进行热稳定性分析。结果：采用２ｍｇ／ｍｌＮＴＧ、ｐＨ８．０、６０ｍｉｎ的诱变条件获 得突变株，将突变株的发酵上清液于７０℃水浴７．５ｍｉｎ，再在３７℃空气浴、反应１０ｍｉｎ的条件下测定 ＭＴＧ活性，从５２００株突变株中筛选出５株产耐高温ＭＴＧ的突变株，其中突变株１２８２在５０℃水浴 ６０ｍｉｎ以及７０℃水浴１．５ｍｉｎ的酶活残留率均比出发株高出近２０％，且８０℃保温２ｍｉｎ仍有１１．９％的 酶活残留率。结论：利用ＮＴＧ诱变结合９６孔板高通量筛选的方法筛选到５株所产ＭＴＧ热稳定性相 对较高的突变株，其中突变株１２８２在５０℃、７０℃和８０℃的酶活残留率均有１０％～２０％的提高。这 为高温食品加工领域所需耐高温ＭＴＧ生产菌株的高效筛选提供了可行性方案。 关键词　茂原链霉菌　谷氨酰胺转胺酶　热稳定性　ＮＴＧ诱变　９６孔板高通量筛选 中图分类号　Ｑ８１９ 　　谷氨酰胺转胺酶（ＥＣ２．３．２．１３，Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ， 加工领域应用的瓶颈。据报道，一些稳定添加剂（糖类、 ＴＧａｓｅ）能够催化蛋白质以及氨基酸分子之间形成 （  醇类、氨基酸及其衍生物、无机盐）会增加 ＭＴＧ的Ｔｍ ε γ ［７］ 谷氨酰）赖氨酸异肽键以及催化谷氨酰胺使其脱氨生成 值 ，所以目前商业化ＭＴＧ产品采用冷冻干燥、低温运 ［１］ 输和大量添加麦芽糊精作为保护剂来增加ＭＴＧ的稳定 谷氨酸残基 。来源于茂原链霉菌的谷氨酰胺转胺酶 ２＋ ［８］ （ｍｉｃｒｏｂｉａｌｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，ＭＴＧ）具有非 Ｃａ 依赖 性 。但是这些方法具有各种局限性且效果甚微，无法 ［１］ ［９］ 性 、纯化工艺简单以及相对于动植物来源提取成本低廉 从本质上解决问题。Ｍａｒｘ等 利用基因工程技术在大 ［２］ ［３］ ［４］ 肠杆菌中表达获得了ＭＴＧ半衰期提高了２７０％的突变菌 等优势，现已广泛应用于食品 ，医药 ，纺织 等行业。 　　然而，由于蛋白质的稳定性易受理化因素影响，ＭＴＧ 株，但是以大肠杆菌为宿主的基因工程菌的安全性有待 在贮存、运输以及食品加工应用中受温度影响较明显，如 考察，使其无法应用于食品领域。 ［５］