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Q—开关激光对黄褐斑动物模型黑素细胞黑素合成影响 　　[摘要]目的：观察Q开关激光不同能量照射对黄褐斑动物模型黑素细胞的增殖、黑素生成及酪氨酸酶活性的影响。方法：用Q开关激光不同能量照射黄褐斑动物模型，取表皮黑素细胞进行细胞培养，采用MTT法测定细胞活力的影响；氢氧化钠裂解法测定黑素的含量；体外多巴氧化反应法测定酪氨酸活性的变化；光学显微镜观察细胞形态学变化。结果：除高能高频组外各能量密度和频率组激光照射后即刻黑素细胞形态无明显变化。第5次治疗后高能量密度照射组明显可见黑素细胞数目减少、体积变小、树突数量减少，长度缩短。而低能量高频率照射组仅黑素细胞体积变小，树突数量减少，长度缩短。与术前比较，低能量低频率照射组黑素细胞增殖、黑素含量、酪氨酸活性无显著差异，但其他三组显著性下降。然而，3周术后黑素细胞增殖、黑素含量、酪氨酸活性增强趋势，有显著性意义（P 　　1.3.2 黑素细胞黑素生成影响的测定[9]：采用NAOH溶解法，取第2代对数生长期的黑素细胞，将处理后的黑素细胞弃去上清液。PBS洗3次，用含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化3min 后，接种及分组同上。然后加入100μl的1mmol/L的NAOH溶液中，37℃孵育1h后，各管加入400μl 的蒸馏水稀释后，用酶标仪测定490nm波长（A）值。根据公式计算黑素相对含量=照射组值A490/对照组值A490×100%。 1.3.3 黑素细胞酪氨酸酶活性的影响测定[8]：氧化多巴反应法测定酪氨酸酶活性，细胞接种与分组同黑素含量测定。取第2代对数生长期细胞，弃培养基，以PBS洗涤2次，每孔加1%TriontX-100溶液50μl，-80℃冻融使细胞破裂，加入1%L-DOPA溶液100μl，37℃反应3h，酶联免疫分析仪测定490nm波长的吸光度值（A）。酪氨酸酶相对活性=照射组值A490/对照组值A490×100%。 1.3.4 细胞形态观察：倒置显微镜观察激光照射后各组培养黑素细胞的形态变化。 1.4 数据统计分析：SPSS17.0统计学软件，数据以（x±s）表示，计量数据采用t检验。组间差异运用方差分析，以P0.05）见表1、图2。 2.3 黑素细胞黑素生成的影响：采用重复测量资料的方差分析，与照射前相比高能高频组、高能低频组和低能高频组黑素含量显著下降，差异具有统计学意义（P0.05）见表2、图3。 2.4黑素细胞酪氨酸酶活性的影响：采用重复测量资料的方差分析，与照射前相比高能高频组、高能低频组和低能高频组酪氨酸酶活性显著下降，差异有统计学意义（P0.05）见表3、图4。 3 讨论 近些年，医用激光技术迅猛发展，在色素性皮肤病的治疗中发挥着非常重要的作用。现阶段Q开关Nd： YAG激光治疗色素增加性皮肤病的机理主要是选择性光热作用理论，但Q开关Nd： YAG激光对黑素细胞黑素合成影响的机制却并不清楚。通过不同能量密度的Q开关Nd：YAG激光对体外培养的人表皮黑素细胞照射实验表明[10]，高能量抑制黑素细胞的黑素合成，而低能量则促进。动物实验也表明[11]，激光能量较低时，可促进黑色素合成，能量较高时抑制黑色素的合成。黑素的合成是个极其复杂的过程，在体内受金属离子、激素、酪氨酸酶等各种因素的调节，但体内和体外是否存在着差异，为我们提出更多的疑问。但这些结果和临床现象为我们的研究提供了理论基础与实验手段和思路。本课题中我们通过观察Q开关Nd：YAG激光照射活体黄褐斑豚鼠模型，并分次取材培养模型表皮黑素细胞研究其对细胞增殖、黑素合成的影响。 实验结果显示与其他组相比高能高频组经第一次照射后即可抑制黑素细胞的增殖，降低酪氨酸酶活性及降低黑素合成量。表明在单位时间内靶目标接受到的照射能量足够大时，黑素细胞吸收的累积热量同样会达到一定的温度，从而导致对黑素细胞的损伤和影响。低能高频组通过多次照射后才显示出对黑素细胞合成功能的抑制作用。表明低能量密度随着多次能量密度的累加，增强到某一程度时才对黑素细胞产生一定的损伤或影响。而低能低频组经过5次照射后无明显变化。更加表明了黑素细胞是可以耐受一定能量密度范围内的照射。激光照射的能量密度只有累积达到一定阈值时，才会对黑素细胞产生影响。由此推论不论高能量或低能量当超过一定耐受阈值时都会对黑素细胞产生影响或损伤，不仅是对色素颗粒的爆破，也能抑制黑素细胞的增殖，降低酪氨酸酶活性及降低黑素合成量。高能量时可能直接导致黑素细胞的损伤或减少，而低能量照射是能量累积的结果。从而解释了临床上Q开关Nd：YAG 1064nm 激光大光斑、小能量、多次治疗黄褐斑引起色素减退的现象[12]，随着累加能量的增多，超过了黑素细胞的耐受阈值。近来大量国内外研究表明，大光斑、低能量多次治疗与高能量、小