九江苦荞组织培养和卡那霉素浓度筛选.docVIP

九江苦荞组织培养和卡那霉素浓度筛选摘要：本试验以九江苦荞为研究材料，下胚轴为外植体，MS为基本培养基，建立组织培养再生体系。通过添加不同浓度的生长素和细胞分裂素，设计不同激素配比组合，相同的培养条件下，研究九江苦荞下胚轴愈伤组织诱导和分化，筛选出诱导九江苦荞愈伤组织和芽分化的最适培养基，为基因工程提供参考。并在不同卡那霉素浓度条件下，研究对愈伤组织和芽分化生长的影响，为农杆菌介导转化的研究奠定基础，为基因工程改良荞麦芦丁生物合成提供了理论依据及技术保证。研究表明：下胚轴诱导愈伤组织的最适培养基为MS+2，4-D 3mg/L+6-BA 0.1mg/L，芽分化和生长的最适培养基为MS+6-BA 3mg/L+IBA 0.5mg/L。荞麦对卡那霉素反应较为敏感，卡那霉素浓度高于25mg/L，可抑制愈伤组织形成芽。 关键词：荞麦；愈伤组织；卡那霉素 荞麦（Fagopyrum esculentum）是蓼科荞麦属的双子叶植物，主要栽培种有甜养和苦养2种。中国是荞麦生产大国，出口量占第一位，总产量居世界第二。不仅具有食用价值，而且具有一定的药用价值和生物学价值。 苦荞是一种优良的黄酮类化合物。据文献报道，荞麦子叶中的总黄酮含量高达6.16%，黄酮具有很强的抗氧化性和清除自由基功能，还是生产芦丁的重要原料。其药理和化学成分研究表明：荞麦中的类黄酮物质芦丁对高血压、糖尿病、心血管疾病等具有良好的治疗效果。 荞麦生理生化和分子生物学上已有一定的研究并取得成功，主要技术是杂交、多倍体和诱变育种。近年来，对荞麦主要致力于它的化学组成，关于荞麦组织培养的研究报道较少。 卡那霉素是氨基糖苷类抗生素，转基因试验中，常作为区分转基因植物细胞与非转基因植物细胞的标记。它作为一个广泛使用的选择剂，在对于转化研究、提高作物产量、拓展药源微生物菌株资源，以及在选育环境治理优良菌株等领域也具有巨大的潜在应用前景。 本试验目的是获得九江苦荞的再生体系，并且筛选出能够促使荞麦愈伤组织芽分化的最低卡那霉素浓度，为农杆菌介导和遗传转化提供参考。 1 材料和方法 1.1外植体材料 挑选由山西省农科院研究所提供的九江苦荞种子，选取籽粒饱满的成熟种子，用75%酒精处理1min，漂洗4～5次，再用0.1%升汞处理8min，漂洗4～5次，将灭菌后的种子接种到附加3%蔗糖、0.75%琼脂粉无激素的MS培养基中，在温度25℃，日照时数12h条件下培养4～5天，获得无菌苗。选取无菌苗的下胚轴作为外植体试验材料。 1.2试验用培养基 基本培养基为MS培养基。 1.3试验试剂 卡那霉素浓度的筛选中，选用的剂量分别为0mg/L、15mg/L、25mg/L、35mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L。 1.4方法 九江苦荞下胚轴愈伤组织的诱导，分别取生长5～15d的九江苦荞无菌苗的下胚轴在75%的乙醇中浸泡1min，蒸馏水漂洗4～5次，0.1%升汞溶液消毒8min，蒸馏水漂洗4～5次，无菌环境中将下胚轴切为约0.5cm×0.5cm的切块，接种于不同激素配比的MS培养基上（表1），温度25℃，湿度75%的条件下暗培养1周并观察记录愈伤情况。诱导出的愈伤组织分别接种于已经设置好的不同培养基中（表2），培养在相同环境中，并观察记录分化情况。 1.5数据分析 试验数据在Excel2003软件中进行初步的录入和处理，计算平均值和标准差，并进一步生成图表。处理间（不同激素配比）的差异显著性在SPSS 15.0软件中采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析，统计显著性P=0.05。 2 结果与分析 2.1九江苦荞下胚轴再生体系的建立 2.1.1激素配比对九江苦荞下胚轴愈伤组织的诱导。愈伤组织诱导过程（激素配比见表1），暗培养1周后再转至光下，2周后形成完整的愈伤组织，随着2，4-D浓度升高而明显膨大，颜色多为红色和黄绿色，当浓度为4mg/L时整个愈伤组织变为水渍状，随着浓度升高而褐变（表3）。 由表3可知：九江苦荞下胚轴在MS+2，4-D 3mg/L+6-BA 0.1mg/L培养基中，愈伤组织为绿白色，致密，愈伤率为92%，为最适培养基，在诱导愈伤组织过程中，2，4-D浓度过高，愈伤组织易发生水渍状，褐化；浓度过低，愈伤组织生长缓慢，不利于分化。 2.1.2不定芽的分化。九江苦荞由下胚轴诱导出的愈伤组织，将其切为0.5cm×0.5cm的切块，接种于不同的培养基中（激素配比见表2），诱导不定芽的产生（表4）。通常在培养基中添加细胞分裂素6-BA和生长素IBA等，可获得再生植株。 表4可知：适当浓度的细胞分裂素和生长素的配比，可提高芽的分化率，下胚轴外植体所诱导的愈伤组