严重烧伤脓毒症患者骨骼肌蛋白降解变化机制探究.docVIP

严重烧伤脓毒症患者骨骼肌蛋白降解变化机制探究 　　[摘要] 目的 研究严重烧伤脓毒症患者骨骼肌蛋白降解变化及机制。 方法 2012年1～6月收集严重烧伤伴脓毒症患者8例为脓毒症组。同时选择整形患者10例作为对照。检测对照组及脓毒症组伤后3、5、7、14、21 d血清中肿瘤坏死因子-α、皮质醇、尿液中3-甲基组氨酸的含量，以及股四头肌中泛素基因表达和蛋白表达。 结果 脓毒症组烧伤后3、5、7、14、21 d各指标均显著高于对照组，差异有统计学意义（P 0.05），有可比性。所有入组患者均知情同意。 1.2 标本采集 收集对照组和脓毒症组伤后3 d、5 d、7 d、14 d、21 d的静脉血标本及24 h的尿标本。所有烧伤患者在切烧伤痂时顺肌纤维方向切取肱二头肌和股四头肌标本，对照组在整形瘢痕切除术时切取股四头肌标本。所有标本分为两部分，一部分采用甲醛固定，一部分置液氮保存。 1.3 检测方法 1.3.1 血标本 采集的静脉血标本静置分层，离心，取上清液进行检测。血浆皮质醇和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）采用化学发光免疫分析法进行检测，试剂盒由上海抚生实业有限公司提供。 1.3.2 尿标本 采用高效液相色谱-荧光检测法测定尿中3-甲基组氨酸。试剂由美国Sigma公司提供。 1.3.3 骨骼肌 ①泛素系统基因表达：一步法提取组织中的总的RNA，逆转录聚合酶联反应进行扩增，引物由赛百盛生物工程技术公司提供。每份RNA中去30 μg进行变性、电泳及转膜，在膜上标记28S rRNA条带和18S rRNA条带。然后将膜放入预杂交液，65℃，共5 h。将cDNA探针加入杂交A液内变性处理，冷却后加入杂交B液中，65℃预热。弃预杂交液，在加入杂交液，过夜。室温洗膜，然后60℃洗膜15 min，2遍。滤纸吸干，-65℃放置24 h，自显影。②泛素蛋白表达：骨骼肌组织石蜡包埋、切片，层厚4 μm，化腊、脱蜡。蒸馏水冲洗，浸泡于过氧化物中，取出过氧化物酶。PBS缓冲液冲洗3次，枸橼酸盐缓冲液中95℃，10 min，进行热修复。分别采用正漏水和PBS液清洗，封闭5 min，加兔抗鼠泛素抗体，37℃ 2 h，PBS液清洗3次，加辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗，37℃作用1 h，PBS液冲洗3次，显色，甲基绿复染，乙醇脱水，封片，观察。 1.4 统计学处理 采用SPSS10.0统计学软件进行数据处理，计数资料采用χ2检验，计量资料采用方差分析和t检验，3-甲基组氨酸与皮质醇和肿瘤坏死因子-α水平的关系采用Pearson相关性分析。P 35次/min，心率140次/min，腹胀、肠鸣音减弱或消失，创面急剧恶化，出现脓毒性休克时出现少尿。1905年Sneve提出严重烧伤患者存在高代谢情况，表现为明显的疲乏、虚弱、消瘦。在烧伤早期，骨骼肌处于高分解代谢状态，这种分解代谢有利于机体的自我保护，为肝脏合成急性期蛋白提供游离氨基酸，为免疫系统及肠上皮细胞提供谷氨酸。但大量肌纤维蛋白的分解，造成负氮平衡，长期下去导致患者抵抗力下降，影响预后[5]。 　　泛素（ubiquitin）是一种存在于大多数真核细胞中的小蛋白。它的主要功能是标记需要分解掉的蛋白质，使其被水解[6]。当附有泛素的蛋白质移动到桶状的蛋白酶的时候，蛋白酶就会将该蛋白质水解。泛素相关酶催化的一系列反应发生的整个过程被称为泛素化信号通路。泛素蛋白降解的途径在骨骼肌代谢中具有重要的意义。泛素化系统主要有三部分，包括蛋白酶体、泛素、泛素相关酶。泛素相关酶包括泛素活化酶、泛素偶联酶、泛素连接酶、泛素链延长酶及去泛素化酶[7]。其中E2-14k酶与骨骼肌的分解代谢具有密切的关系。C2亚基是蛋白降解的中心结构。本研究显示，脓毒症患者泛素 mRNA、E2-14k、C2亚基mRNA的表达均显著高于对照组，说明脓毒症患者存在明显的骨骼肌分解代谢。 3-甲基组氨酸是1-甲基组氨酸的同分异构体，是肌动蛋白的一个组分。1967年Johnson等发现肌动蛋白和肌球蛋白中均含有3-MH，蛋白结合状态的3-MH主要分布在骨骼肌内。3-MH主要通过尿路排泄。当肌肉分解代谢时，3-MH同其他氨基酸一起释放入血，然后经过尿排出。因此测定尿液中3-MH的含量是肌肉蛋白质分解代谢的可靠指标。本研究结果也显示，脓毒症组尿3-MH显著高于对照组，且在烧伤后7 d达到峰值，随后逐渐下降。 TNF-α是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一，属于炎症因子，在机体处于感染的情况下，TNF-α分泌增加。皮质醇是由肾上腺皮质分泌的一类甾体激素，具有调节糖、脂肪、和蛋白质的生物合成和代谢的作用，还具有抗炎作用，当