生物物理课-8膜蛋白的结构研究.ppt

跨膜电位 Andersson等人研究了跨膜电位??+对Lep拓扑取向的影响，其实验思路基本如下：构建Lep突变体，在其N端引入四个正电残基以强化正电荷因素的影响。使用Trp水解实验测定其翻转构象所占比例。当加入消除膜电位的试剂CCCP重复上述实验时，发现采取翻转构象的比例显著减少，说明正电朝内原则是依赖于膜电位的。这一点从直观上也是比较容易理解的，因为正常细胞都具有内负的跨膜电位，从能量上讲正电荷富集区域位于内侧也是有利的。 膜上负电脂所占比例 Kruijff等人研究了生物膜上负电脂所占比例对蛋白质拓扑取向的影响，其实验的对象仍然是Lep蛋白。他们首先构建了E.Coli突变株HDL11，在该突变株中，psg基因前加入了一个Lac promoter。psg基因编码的蛋白是合成负电磷脂必须的一个重要酶，在引入promoter以后该基因的表达将受到IPTG诱导调控。在加入IPTG的情况下，基因正常表达，细菌内膜上含有正常比例的负电脂（PG16％，CL3％）；而不加IPTG时，基因基本上不表达，负电磷脂的合成受到影响。实验表明PG含量下将至2％，CL含量下将至1％，虽然细胞会通过一些其它途径使酸性磷脂含量略增，但总的来说，负电脂所占比例不超过9％。在这种情况下，再利用N端增加了四个正电残基的Lep突变体实验，发现加入IPTG时，翻转构象比例较大，而不加IPTG时，翻转构象比例下将。这说明，正电朝内原则是依赖于生物膜上酸性磷脂所占比例的 登顶成功，可惜神仙都被一脸幸福地俺们吓跑了。 膜分子生物学 游击队 8.膜蛋白的结构研究 膜蛋白的结构研究 蛋白的膜拓扑学研究 蛋白质的晶体学研究: X-ray; EM 蛋白质的单颗粒研究: EM; AFM 蛋白质结构的波谱技术:荧光; CD; NMR 膜蛋白的结构研究 蛋白的膜拓扑学研究 蛋白质的晶体学研究: 3D; 2D 蛋白质的单颗粒研究: EM; AFM 蛋白质结构的波谱技术 蛋白的膜拓扑学(membrane protein topology) 蛋白质序列中的跨膜区段，即蛋白质的哪些部位插入膜内 蛋白质在膜上的整体取向，一般即蛋白质的哪一端位于细胞膜的外侧，哪一端位于细胞膜的内侧，以及各部分之间的相对取向 蛋白的膜拓扑学研究 膜蛋白拓扑取向的基本原理 蛋白膜拓扑学研究常用方法 影响蛋白拓扑取向的因素 膜蛋白拓扑取向的基本原理 疏水性原则 视紫红质蛋白的嗜水性分析图谱。图谱表明该蛋白存在7个大片疏水区域，由此得出视紫红质7次跨膜的结论 膜蛋白拓扑取向的基本原理 正电氨基酸朝内原则 对已知结构的细菌内膜蛋白统计发现，带正电的氨基酸一般位于朝向胞质侧（cytoplasmic），即大部分带正电菏的残基在转运过程中都不能被转运过膜。 只有对长度较短的蛋白片断，正电残基朝内原则才成立（一般不超过60氨基酸），而且在这个范围内，正电氨基酸出现在膜内侧的比例随着片断长度的增加而减少 根据35个细菌内膜蛋白的统计结果，胞质腔蛋白loop区与周质腔蛋白loop区中正电荷氨基酸(Lys和Arg)所占比例的比较(A)；以及胞质腔蛋白loop长度与周质腔蛋白loop长度的分布(B)。其中，黑色表示蛋白胞质区片断(cytoplasmic loop)而白色表示蛋白周质腔片断(periplasmic loop)，横坐标为loop长度。 正电氨基酸朝内原则 蛋白的膜拓扑学研究 膜蛋白拓扑取向的基本原理 蛋白膜拓扑学研究常用方法 影响蛋白拓扑取向的因素 蛋白膜拓扑学研究常用方法 理论分析：蛋白质嗜水性分析 实验分析： 蛋白水解法 免疫方法 化学标识法 特殊部位定位法 融合蛋白法 蛋白膜拓扑学研究常用方法 理论分析：蛋白质嗜水性分析 关于疏水作用 疏水物质在水中聚集熵增加是自发过程！ dS 0 贡献是主要的！ dH ? 0 minimal ！ 当一个疏水性分子（与水分子之间不能形成更强的氢键）进入水相时，由于影响系统自由能的主要是熵变过程，外来分子会发生聚集，以尽量减少其周围有序水分子的数目。表观上看，好象有一种力（疏水力）的作用使它们结合到了一起。 关于疏水作用 K.Kauzmann (1959)研究非极性残基从非极性溶剂转移至水中的热力学性质. 模型系统：非极性分子 甲烷(CH4) 非极性溶剂 苯或CCl4 问题的提出：X mole 甲烷从CCl4中移至水中free energy 如何变化？ 由dG = dH – TdS 转移过程：dH (enthalpy) 0 放热导致 dG降低 dS (entropy) 0 熵降低导致dG增加 由于dS对dG的贡献达到80%,故甲烷从CCl4中移