生物物理课 膜蛋白的结构研究.ppt

膜蛋白的结构研究;生物电子显微学 ;电子显微学研究生物大分子结构的主要方法;三维重构梗概中心截面定理与三维重构示意图。(A)：在X射线晶体学中通过对整个三维晶体的X射线衍射直接获得Fourier倒易空间的衍射信息，其与时空间的三维晶体是对应关系。(B)：在电子晶体学中，通过不同方向的投影及数字Fourier变换，获得的是其Fourier倒易空间不同中心截面的衍射信息，将所有不同方向投影的中心截面整合到一起，可以获得物体在整个三维Fourier倒易空间的衍射信息，通过逆变换同样可以获得该物体在实空间的图象。 ;三维重构的基本原理(中心截面定理) 将电子显微图像(实空间)进行傅里叶变换(倒易空间)，一张显微图像的傅里叶变换相应于成像物体在三维傅里叶变换(倒易空间)的一个通过中心的截面。通过改变生物样品在电镜下的倾斜角度，就可以得到相当于傅里叶变换(倒易空间)的其它通过中心的截面。收集在不同倾斜角度下样品的显微图像，经过傅里叶变换就可以获得一套完整的三维倒易空间数据。对样品的三维倒易空间数据进行傅里叶逆变换运算就可以获得该样品在实空间的三维结构图像。 ;电子晶体学（Electron Crystallography）;;电子晶体学的优势： 1.可以直接得到膜蛋白的结构信息以及与膜相关蛋白在膜上的结构信息。 2.可以获得高分辨率的结构，尤其适用于难于三维结晶的膜蛋白。 Bacteriohodopsin, Henderson et al.,1990; Plant light-harvesting complex, Kuhlbrandt, Wang, 1994; Aquaporin, Murata et al., 2000. ; 近年来迅速发展起来的单颗粒方法 （Single Particle Technique）是生物电子显微学的新方法,它克服了晶体学的限制。 顾名思义，单颗粒方法是对分离的，非有序排列的，但是相同的颗粒进行结构解析。其所采用的基本原理是通过对相同的生物大分子某方向的投影显微像在实空间中经过调整后进行叠加平均，从而提高信噪比，使粒子中共同部分的结构信息得到加强，最后对各种不同投影方向的单颗粒显微像在三维空间中进行重构，从而获得单颗粒大分子的三维结构信息。 由于它处理的是同一大分子随机散布的电镜照片，所以没有形成晶体的要求。另外，单颗粒方法处理的生物大分子没有质量上限，而且分子越大，结果越好。; 锥形采集法模型示意 ;单颗粒技术（Single Particle Technique）;;单颗粒技术的优势： 1.不需要二维晶体； 2.适于解决生物大分子复合体系的结构 应用举例： 用单颗粒技术研究核糖体(ribosome)的结构及其功能机制。;电子断层成像术（Electron Tomography);;Electron Tomography 的优势： 1.适于解决不具备周期性或全同性的生物大分子复合体系的结构； 2.适于揭示亚细胞层次的复杂结构。 ; Docking Technique;;Docking Technique：把X射线晶体学的原子分辨率结构与电子显微术的分子分辨率结构结合起来构筑细胞基本结构体系！The era of docking is coming !;膜蛋白的结构研究;生物大分子的单颗粒观测 生物大分子单颗粒的原子力显微镜 (AFM)研究 ; 原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）已经成为一种对细胞及生物大分子形态结构进行观测的有力工具。其主要原因有两个，1. 原子力显微镜作为扫描探针显微镜的一种，构建了一种在中等量级（亚微米）上对于生物系统的一般形态结构进行研究的工具；2. 利用AFM，可以使得细胞及生物大分子在生理溶液的条件下成象。 因此，AFM对于生物系统的成象分析比光学显微镜具有更高的分辨率(大约可以达到1nm)，比电子显微镜观测所需要的样品处理更接近于生理条件，并且比光谱学技术（通常需要从大量光谱信号中间接推导出结构信息）更直观。而相对于晶体学方法来说，AFM分析不需要依靠于晶体样品，这非常有利于研究天然状态下的生物样品。;AFM实验装置(a)带有尖端的悬臂在样品表面正上方进行扫描，通过包括激光二级管和光电二极管的光学系统记录其反射。(b)AFM尖端与柔软表面(例如生物膜)间相互作用的放大图。;与双分子脂膜结合的毒素的AFM观测。 霍乱毒素B亚基(B5)与DAPC-25/GM1 (4:1)组成的双分子脂膜的结合。低分辨的AFM观测(a)和高分辨下呈现的结构(b)。;AFM作为测量表面力的装置;亲和素化的AFM尖端悬臂的表面以及生物素化的琼脂珠表面的示意图(A)，注意琼脂