分子标记株鸭圆环病毒感染性核酸的构建.pdfVIP

中国畜牧兽医 2010年第 37卷第 9期 生物技术 ·91 · 分子标记株鸭圆环病毒感染性核酸的构建 万春和 ，傅光华 ，施少华 ，程龙飞 ，陈红梅 ，黄瑜 (福建省农业科学 院畜牧兽医研究所 ，福州 350013) 摘要 ：以临床分离 的鸭 圆环病毒 (duckcircovirus)(GenBank登录号：GU168779)阳性病料为材料 ，根据 GenBank中所登录 的鸭厕环病毒基用序列设计引物并对设计 的引物5末端进行磷酸化处理 ，通过引物设计 替换碱基 ，以突变形成 Ec’oRI酶切位 点 。利用 PCR方法扩增鸭 圆环病毒的基 ，经胶 回收后 ，用 T4DNA连接酶进行环化 ，以获得鸭 圆环病毒具有感染性 的核 酸 。在含有分子标记的两端设计引物 ，进行 PCR扩增 ，对 PCR产物进行胶 回收 ，连接 T载体后测序，对胶 回收产物进行 EcoR I酶切鉴定 ，均证 明在第 587f__7；=成功插入 EcoRI酶切位点 。结果表明，本试验已成功构建带有分子标记的鸭圆环病毒的感染 性核酸 ，为进一步开展该病毒 的分子调控机制 、致病性和开发基冈丁程疫苗研究奠定基础。 关键词 ：鸭劂环病毒 ；分子标记；感染性核酸 中图分类号 ：Q78 文献标识码 ：A 文章编号 ：1671—7236(2010)09-0091O3 根据 国际病毒分类 委员会 (internationalCOFI1一 致病性病毒 ，各 品种鸭均见有感染 ，可侵害免疫系 mitteeontaxonomyofviruses，ICTV)最新 的病毒 统 ，导致机体免疫功能下降 ，易遭受其他疾病的并发 分类报告 ：圆环病毒科 (Circoviridae)包括 2个属 ： 或继发感染 ，从而造成更大的经济损失 (万春和等 ， 圆圈病毒属 (Gyrovirus)和 网环病毒属 (Circovir— 2009)。到 目前为止 ，网环病毒属除 PCV(PCV1和 us)。圆圈病毒属 只有鸡贫血病毒 (chickenanemia PCV2)可以在 PK一15细胞 中繁殖外 ，其余成员均 尚 virus，CAV)一个成员 ；而圆环病毒属 目前有包括猪 未能细胞培养 ，大大限制 了对其的深入研究。为此 ， 圆环病 毒 1型和 Ⅱ型 、鹦鹉 喙羽病 毒 (psittacine 初步构建带有分子标记 的鸭圆环病毒 (GenBank登 beakandfeatherdiseasevirus，PBFDV)、鸽网环病 录号 ：(U168779)全基 因的感 染性核 酸 ，并对其进 毒 (pigeoncircovirus，PiCV)、鹅 圆环 病 毒 (goose 行序列分析和酶切鉴定 ，为开展鸭圆环病毒 的分子 circovirus，GoCV)和鸭 圆环病毒 (duckcircovirus， 调控机制 、致病机理等生物学特性和开发基因工程 DuCV)等成 员 (Iefebvre等，2009；Ypelaar等 ， 疫苗研究奠定基础 。 1999；Mankertz等 ，2000；Todd等 ，2001；Hatter— 1 材料与方法 mann等 ，2003)。近年来 ，还 在金丝雀 (canarycir 1．1 主要试 剂 蛋 白酶 K 购 自Merck公 司；SDS covirus，CaCV)、天鹅 (muteswans(Cygnusolor) 购 自Sigma公司 ；Pyrobest…DNA Polymerase、Ex circovirus，SwCV)、雀 (finchcircovirus，FiCV)、渡 Taq 、DNA Marker、dNTPMixture(2．5mmol／I 鸦 (ravencircovirus，RaCV)、鸥 (gullcircovirus， each)、T4DNA连接酶和 pMD18-T载体均购 自宝 GuCV)和八哥 (starlingcircovirus，StCV)等动物检 生物T程 (大连)有限公 司，胶 回收试剂盒、质粒纯化 测到圆环病毒 (Todd等 ，2001；Steward等 ，2006； 试剂盒均购 自Omega公司。其它试剂均为商业公 Johne等 ，2006；Todd等 ，2007；Halami等，2008)。 司购买 的分析纯。