碳源对重组大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的影响-生物通.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（３）：５７～６２ 碳源对重组大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的影响 王益娜　马江锋　陈可泉　左　鹏　吴晓花　姜　岷 （南京工业大学制药与生命科学学院材料化学工程国家重点实验室　南京　２１０００９） 摘要　研究了在好氧培养基中分别添加不同碳源对两阶段发酵菌体生长、酶活及代谢产物分布 的影响，结果表明添加４ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖和１２，５４，８０ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸钠均可以提高好氧阶段的菌体密 度和相关酶活。将不同条件下培养的菌体转接厌氧发酵后，厌氧阶段的酶活和代谢产物分布也 发生改变。进一步对酶活及代谢产物分析表明：ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮＺＮ１１１（ｓｆｃＡ）厌氧发酵过程中，磷 酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（ＰＣＫ）是产丁二酸的关键酶，丙酮酸激酶（ＰＹＫ）主要和副产物丙酮酸 的积累有关，异柠檬酸裂解酶（ＩＣＬ）对丁二酸产量也有一定影响。好氧培养基中添加８０ｍｍｏｌ／Ｌ 乙酸钠，厌氧发酵结束时丁二酸的质量收率可达８９．０％，相比对照提高了１６．６％。 关键词　大肠杆菌　碳源　两阶段发酵　丁二酸 中图分类号　Ｑ８１５ 　　丁二酸又称琥珀酸，是三羧酸循环的中间产物，广 原电位在大肠杆菌发酵产丁二酸中的重要性，在培养 泛存在于人体、动物、植物和微生物中，其作为优秀的 基中添加不同还原性碳源作为底物发酵，结果表明山 Ｃ４平台化合物，可用于合成 １，４丁二醇、四氢呋喃、 γ 梨醇能够提供更多的还原力，更利于丁二酸的积累。 丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯（ＰＢＳ）类 本实验主要通过代谢控制对两阶段发酵进行调控，在 生物可降解材料，被美国能源部认为是未来 １２种最有 好氧培养基中添加葡萄糖或乙酸钠作为碳源，改变菌 价值的生物炼制产品之一［１，２］。 体好氧时的生理状态，转接厌氧发酵后使酶活及代谢 　　发酵法生产丁二酸具有利用可再生资源，固定温 产物分布发生改变，可以提高丁二酸的产量。 室气体ＣＯ等优点越来越引起人们的兴趣。大肠杆菌 ２ 由于具有培养条件简单，代谢网络较明确，易改造，易 １　材料与方法 操作等特点，近年来成为生物法合成丁二酸的研究热 １．１　材　料 点。其中以Ｅ．ｃｏｌｉＮＺＮ１１１为出发菌株构建的Ｅ．ｃｏｌｉ １．１．１　菌株　Ｅ．ｃｏｌｉＮＺＮ１１１（Ｆ ｐｆｌ：：ＣａｍｌｄｈＡ：： ＡＦＰ１１１和ＡＦＰ１８４系列菌株被认为是比较具有产业化 Ｋａｎ）／ｐＴｒｃ９９ａｓｆｃＡ（本实验室构建并保藏）。受体菌 ［３～５］ 前景的丁二酸生产菌株 。 ＮＺＮ１１１由 ＤａｖｉｄＰ．Ｃｌａｒｋ教 授 （ＳｏｕｔｈｅｒｎＩｌｌｉｎｏｉｓ 　　本实验室前期将苹果酸酶过量表达于 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）惠赠，其中编码丙酮酸甲酸裂解酶的ｐｆｌ基 ［６］ ＮＺＮ１１１中 ，恢复其在厌氧条件下利用葡萄糖的能 因和乳酸脱氢酶的ｌｄｈＡ基因分别被带有氯霉素和卡那 力，同时积累高浓度丁二酸，副产物丙酮酸、乙酸积累 霉素抗性基因的片断插入失活。表达载体 ｐＴｒｃ９９ａ ［７］ 较少，未检测到甲酸和乳酸。Ｈｏｎｇ等 对过量表达苹 ｓｆｃＡ由本实验室构建并保藏，其中带有氨卞青霉素抗 果酸酶的Ｅ．ｃｏｌｉＮＺＮ１