不同保存方式下金龟甲虫DNA提取方法及28S rDNA序列分析.pdfVIP

第25卷 第6期 沈 阳 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 ) Vo1．25，No．6 2013年 12月 JournalofShenyangUniversity(NaturalScience) Dec． 2013 文章编号：2095—5456(2013)06—0436—05 不 同保存方式下金龟 甲虫DNA 提取方法及 28SrDNA序列分析 贾晨曦 ，郭晓华 ，刘广纯 (沈阳大学 a．生命科学与工程学院，b．辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室，辽宁 沈阳 110044) 摘 要：通过电泳检测和 PCR扩增28Sr亡INA核基因序列的结果，比较了无水乙醇、75 乙醇、针插干 制 3种金龟甲虫标本的保存方式和 SDS一蛋 白酶 K法、CTAB法、饱和 NaC1法 3种提取 DNA方法．结果显 示，SDS一蛋白酶K法、CTAB法提取3种保存方式的标本时，可成功提取 DNA并有效扩增 目的基因；饱和 NaC1法仅能提取无水乙醇保存标本的DNA并扩增 目的基因，而75 乙醇保存标本和干制标本的DNA提取 和基因扩增均不理想． 关 键 词：金龟子；标本；保存方法；DNA提取；28SrDNA 中图分类号：Q 969．516．1 文献标志码：A 核酸序列携带生物起源、进化、种群多样性等 捕捉法采集． 重要信息[1]．核酸序列研究的重要前提是提取基 1．2 方 法 因组DNA．金龟子是鞘翅 目中较大的类群之一， 1．2．1 标本保存 具有重要的经济和生态价值．植食性种类多是农 (1)乙醇浸制标本．将采集的金龟子预先饥 作物、林木、果树的重要害虫；粪食性或腐食性种 饿 24h以上，使其消化道 内物质消化完全 (防止 类有清除粪便等保护环境作用．由于标本采集受 外源DNA对 目的DNA的干扰)，分别浸入无水 季节、地域等因素限制，用活体或新鲜标本作为试 乙醇及 75 乙醇中，12h置换 1次乙醇，更换 3 材较为困难，标本保存方式十分重要[2]。DNA成 次后于4℃冰箱保存，制成浸制标本． 功提取也受提取方法的直接影响[33。∞．有关昆虫 (2)干制标本．将样本饥饿24h后，用昆虫针 标本保存和基因组DNA提取方法的研究曾有过 插于标本盒中，置于通风处 自然阴干制成干制 报道[4]，但金龟子相关研究报道十分有限．探讨金 标本． 龟子标本的最佳保存方式和 DNA提取方法，对 1．2．2 基 因组 DNA提取 于研究金龟类昆虫的分子系统发育关系，尤其对 采用 SDS蛋白酶K法、CTAB法、饱和NaC1 昆虫分类新型技术——DNA条形码的研究具有 法 3种方法提取 DNA．用无菌水清洗金龟子标本 重要意 s-． 胸部 3～5次，并用滤纸吸干． (1)SDS蛋白酶 K法．①取虫体胸部肌 肉 1 材料与方法 0．1N0．2g，放人 2．0mlEP管中，加入500 L匀 1．1 材 料 浆液 (0．1mol／LEDTA，pH一8．0；0．1mol／L 以金龟科 Scarabaeidae星花金龟属 Potosia NaC1；0．05mol／L Tris—HC1，pH 一 7．6；1096／ 的白星花金龟Potosia(L．)brevitarsis(Lewis)作 SDS；2mg／mL蛋 白酶 K)和少许灭菌的细石英 为实验材料． 砂，用玻璃棒研磨充分．②将研磨好的混合液置于