平滑肌肌球蛋白轻链激酶的非激酶作用及对ATP酶活性的调节.PDFVIP

ISSN 中国生物化学与分子生物学报 2007 年 5 月 CN 　113870Q Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 23 (5) :375～381 平滑肌肌球蛋白轻链激酶的非激酶 作用及对 ATP 酶活性的调节 2) 1) 1) 2) 1) ,2) 崔 　颖 , 　李晓丽 , 　梁明丽 , 　陈海波 , 　高 　颖 ( 1) 大连医科大学生化教研室 ,2) 辽宁省医学细胞分子生物学重点实验室 ,大连　116027) ( ) 摘要 　肌球蛋白轻链激酶 myosin light chain kinase , MLCK 具有激酶活性和非激酶活性 ,在平滑肌 收缩过程中起着关键酶调控的作用. 为探寻 MLCK 的非激酶活性区域对MLCK 活性的影响 , 以进一 步阐明 MLCK 的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制. 采用 PCR 技术构建 MLCK 部分 氨基酸缺失的重组表达载体 p GEXF65D ,经大肠杆菌表达得到可溶性 GST 融合蛋白 ,利用 SDS PAGE 及 Western 印迹鉴定表达的MLCK 在细胞中的分布 ,结果还显示 ,提取液的上清和沉淀中均有 ( ) MLCK 片段的表达. 运用亲和层析技术分离并纯化删除前、后表达的 MLCK 片段 F65 和 F65D , 经谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B 纯化 ,SDSPAGE 鉴定显示为单一表达条带. 应用 EnzChek 磷分析试剂盒 2 + 和孔雀绿两种方法分别测定不同浓度的 MLCK 对非磷酸化肌球蛋白 Mg ATP 酶活性的影响. 两种 MLCK 的片段均具有激活ATP 酶活性的作用 ,并随 MLCK 浓度的增加 ,酶的活性增加. 比较删除前 后不同MLCK 片段对ATP 酶活性的影响结果显示 ,删除MLCK 片段 1002 位丙氨酸至 1019 位亮氨酸 后 ,对ATP 酶的激活作用较删除前明显降低 ,表明删除的部分氨基酸序列为MLCK 非激酶活性所必 ( ) 需的区域. 利用电镜技术观察到 MLCK 片段 F65 使非磷酸化肌球蛋白构象发生明显的变化. 加入 MLCK 片段后肌球蛋白的构象由非活性型转化为活性型 ,并且 MLCK 片段还具有促进肌球蛋白单 体形成肌丝的作用. 2 + 关键词 　平滑肌收缩 ;肌球蛋白轻链激酶 ;肌球蛋白