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基因工程工具酶和载体 课程 基因工程原理与技术 班级 生物科学05 生物技术05 教师 詹亚光 范桂枝 学期 第二学期 课时 4学时 上课日期 课的类型 理论 授课章节 第二章 基因工程工具酶 第一节 常用工具酶 1. 限制性内切酶 2. 连接酶 3. DNA聚合酶 4. 基因工程中所用的其他酶类 第二节 基因工程的载体 1. 载体的基本条件 2. 质粒载体 3. 噬菌体载体 4. 植物基因工程载体 教学目的和要求 掌握基因工程常用工具酶的种类、特性和用途；基因载体的条件、类型、特点和用途 教材分析 重点 工具酶的功能和反应条件、载体的功能 难点 工具酶和载体的用途 关键点 限制性内切酶和质粒载体的功能 主要教具和设备材料 投影仪、电脑、常规教学设备 教法 板书与多媒体授课相结合 思考题 为什么大数内切酶被称为“限制”酶？ 2. 何为限制性内切酶的星号活性？受哪些因素影响？ 3. 影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？ 4. 如何利用T4DNA聚合酶制备3′隐含末端或双链平末端？ 5. 按适当的顺序，列出将一种mRNA的cDNA克隆到表达载体所用到的酶？ 心得 第一节 基因工程工具酶的概念 基因工程的工具酶（instrumemtal enzyme of gene engineering）是应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取、重组体DNA制备等程序中所需的酶类。基因工程常用的工具酶，主要是限制性核酸内切酶、DNA连接酶和DNA聚合酶等（表1）。 表1 基因工程常用的工具酶 酶 主要用途 限制性核酸内切酶 识别DNA特定序列， DNA聚合酶I或其大片段 （1）缺口平移制作标记DNA探针 （2）合成cDNA第二链 （3）填补双链DNA3′凹端 （4）DNA序列分析 耐热DNA聚合酶 聚合酶链反应 DNA连接酶 连接两个DNA分子或片段 多核苷酸激酶 催化多核苷酸5′羟基末端磷酸化，制备末端标记探针 末端转移酶 在3′末端加入同质多聚物尾 SI核酸酶 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端 DNA端酶I 降解DNA，在双链DNA上产生随机切口 RNA酶A 降解去除RNA 磷酸酶 切除核酸末端 一、 限制性内切核酸酶 （一）限制性内切酶（Endonucleosase）的发现与分类 限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4~8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 1） 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制－修饰，它们由三个基因位点所控制：hsd R, hsd M, hsd S, 十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理： 　　hsd R---限制性内切酶 　　hsd M---限制性甲基化酶 　　hsd S---控制两个系统的表达 1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，Hind II和Hind III，为基因工程技术的诞生奠定了基础。 截止到目前为止，已经分离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有一百种，而实验室常用的有二十种。 2）限制性核酸内切酶可分为三大类： 　　　I类 能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。　　　II类 识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断 　　　III类 识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。　　因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。 （二）限制性核酸内切酶的命名 由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统一的命名体系。Smith和Nathans(1973)提出了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系的一个简化版。其主要特征是： 1. 宿主生物的种名由其属名的首字母和其种加词的头两个字母形成的三字母缩写来注明。该缩写向来用斜体。 2. 如果来自于某个特定的菌株，则需注明。 3. 当某个特定的宿主菌株具有几个不同的R—M系统时，它们要用罗马数字注明。在表3．2中列举一些例子。 表2 限制性内切酶命名法举例 酶 酶来源 识别序列 Sma I Hae Ⅲ Hind Ⅱ Hind Ⅲ BamH I 黏质沙雷氏菌，第一个酶 流感嗜血菌埃及生物群，第三个酶 流感嗜血菌菌株d，第二个酶 流感嗜血菌菌株d，第三个酶 解淀粉芽孢杆菌，菌株H，第一个酶 CCCGGG GGCC GTPyPuAC AAGCTT CCATCC 自引导的内切酶的命名法与此类似，但是