P.fluorescens发酵生产胞外多糖的结构分析及活性评价Structure analysis and activity evaluation of extracellular polysaccharide produced by P.fluorescens fermentation.pdfVIP

P. fluorescens 发酵生产胞外多糖的结构分析及活性评价 摘 要 近年来，多糖作为一种活性物质市场需求量日益增大，细菌胞外多糖是细菌 液体发酵代谢产生的，利用细菌代谢产糖具有周期短、产量高、质量稳定的优点， 是工业生产多糖的一种高效、节能的方式。不同产糖菌株所需要的生长条件差异 很大，经过定向筛选的产糖菌株通过优化培养可以不同程度的提高胞外多糖的产 量，这些胞外多糖一般都具有潜在的生物学活性。本论文对实验室前期从啤酒大 麦中分离筛选出的一株细菌菌株进行了研究，发现其胞外多糖产量和性状相对稳 定。以胞外多糖产生量为指标，对该菌液体发酵产胞外多糖的培养条件进行了优 化；采用高效凝胶渗透色谱法、气相色谱法、酶解法、液质联用技术以及核磁共 振技术对该胞外多糖的结构进行了分析；在此基础上初步探索了该胞外多糖体外 吸湿保湿性能及抗氧化活性。主要研究内容及结果如下： 1. 对目标菌株进行形态学和分子生物学的鉴定，经形态学特点和 16SrDNA 鉴定为荧光假单胞菌，命名为 Pseudomonas fluorescens PGM37 ，目前保存于中国 典型微生物保藏中心，保藏号为 CCTCC NO. M2012183 。 2. 通过单因素和响应面实验相结合的方法，确定了 P. fluorescens PGM37 发 酵产胞外多糖的最适培养条件为：初始 pH 7.5 ，摇瓶装液量 100 mL/250 mL，接 种量 5%，培养温度28 ℃，摇床转速 180 rpm；产糖的最佳培养基组成为：蔗糖 36.2 g/L，酵母膏 3.3 g/L，NaCl 1.1 g/L ，CaCl2 0.2 g/L。在上述培养基组分和培 养条件下发酵 36 h，所得产量为 10.1163 g/L。通过测定发酵曲线得到该菌株产糖 量在 48 h 时达到最高，为 11.37 g/L。 3. 对多糖提取工艺进行优化，选择调节发酵液 pH 为 8，2.5 倍乙醇沉淀多 糖，用去离子水复溶后再次醇沉，冷冻干燥后得多糖粗品，经过 Sephacryl S-300HR 柱层析纯化得到分子量均一的多糖纯品，经过高效凝胶渗透色谱法确定 胞外多糖分子量为 367.6 kDa 。 4. 经过气相色谱分析得到该多糖由甘露糖和葡萄糖以 1:1 的比例构成。红外 光谱和一维核磁均显示该糖为 β-D-吡喃型且无其他取代基团。利用专一性降解 酶水解该胞外多糖，将酶解产物分级醇沉分离后进行 ESI-LC-MS 分析，同时结 合 1D NMR 和 2D NMR 以及红外光谱确定其结构重复单元为 β-D-Glcp -(1, I 4)-β-D- Manp -(1, 4)-β-D-Glcp -(1, 4)-β-D-Manp 。 5. 对 P. fluorescens PGM37 胞外多糖的体外吸湿保湿和抗氧化活性进行探 究，该多糖保湿性能远远优于甘油并仅次于透明质酸，在一定的浓度范围内可以 达到水分含量的动态平衡；多糖对·OH、DPPH ·自由基的清除、抗以卵黄脂蛋 白为底物的脂质过氧化均具有显著的效果，且存在良好的量效关系，随着 EPS 浓度的增大，其清除或抑制效果增强，EC50 值分别为 7.44 mg /mL、16.76 mg/mL、 17.18 mg/mL，具有较强的体外抗氧化活性，在化妆品和医药方面有着潜在应用 价值。 P. fluorescens PGM37 胞外多糖和植物魔芋葡甘聚糖（KGM ）结构具有很大 的相似性，而KGM 现已被国内外学者多次证实具有很好的吸湿保湿以及抗氧化、 抗肿瘤活性等，探索实验证明该胞外多糖也具有一定的吸湿保湿和抗氧化生物性 能。目前未见报道有微生物产此种类的葡甘聚糖，当前的葡甘聚糖仅有魔芋这一 单一植物来源。P. fluorescens PGM37 产糖培养基成分要求简单、产量稳定、生 产成本低，适合工厂的规模化生产，有很大开发前景。本论文的研究为微生物来 源的葡甘聚糖的工业化生产、探索结构和活性的关系以及潜在的开发应用提供理 论基础。 关键词：Pseudomonas fluorescens ；胞外多糖；发酵；结构；活性 II Structure analysis and biological activit