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人参内生细菌NJ13在宿主体内定殖特性和对人参黑斑病防治效果 　　[收稿日期] 2013-10-22 [基金项目] 吉林省科技厅重点科技攻关项目（20140204055NY）；国家大学生创新创业训练计划项目（201310193001） [通信作者] *陈长卿，副教授，研究方向为药用植物病害生物防治，E-mail：ccqjy@163.com [摘要] 为明确人参内生生防细菌NJ13在宿主体内的定殖特性，该研究通过抗生素诱导获得了同时对利福平和硫酸链霉素具有稳定抗性的双抗标记菌株NJ13-R，分析了菌株在宿主体内的定殖特性，并研究了NJ13对人参黑斑病的田间防治效果。结果表明，菌株在人参根、茎、叶部均可定殖，而且定殖量与接种浓度呈正相关。菌株可在人参不同部位侵染植株并在体内进行转移，在根部和叶部定殖量表现为先升后降的变化趋势，而在茎部呈先升高后平缓趋势。研究还发现，生防细菌NJ13表现出对宿主特定部位具有一定的偏好性，随着时间推移在茎部的定殖量高于其他部位。田间试验证明，生防细菌NJ13对人参黑斑病具有较好的防治作用，其中0.76×108 cfumL-1发酵液防效达75.62%，高于对照药剂0.67 mgL-1 50%嘧菌环胺WG的防效（73.06%）。 [关键词] 内生细菌； 定殖； 人参黑斑病； 生物防治 人参Panax ginseng CA Mey为五加科人参属多年生宿根草本植物，是我国传统的名贵中草药，素有“百草之王”的美誉，主要分布在我国东北长白山地区。由链格孢菌Alternaria panax Whetz.引起的人参黑斑病，是人参生产上发生最为普遍、分布最为广泛、为害最为严重的病害之一。该病害主要为害人参地上部，包括叶片、茎秆、花梗和果实等部位，尤以叶斑和茎斑发生最为普遍，吉林省高发期集中在7―8月份，常年发病率在20%～30%，严重时可达80～100%，造成早期落叶、植株枯萎、不结实，参根和参籽减产，品质下降[1]。目前，生产上人参黑斑病主要以化学防治为主，然而在病害防治过程中化学农药的不科学使用，暴露出了人参农药残留超标、出口率降低、病原菌抗药性产生以及污染生态环境等系列问题。因此，生物防治等更为安全有效的防治措施研究亟待开展。 目前国内外关于人参黑斑病生物防治的研究报道相对较少，主要集中在生防菌的分离筛选及发酵条件研究。崔立萍等[2]从土壤和人参黑斑病菌组织中分离筛选出对人参黑斑病菌有拮抗作用的菌株22个。李勇等[3]从人参根中分离出40株内生细菌，通过对峙培养筛选获得了对人参黑斑病菌有抑制作用的内生细菌Stenotrophomonas maltophilia和Bacillus sp.。周如军等[4-5]从人参根际土壤中筛选到对人参锈腐病菌有拮抗活性的细菌2株和真菌1株，其对人参黑斑病菌有一定的抑菌效果，并对上述菌株进行了鉴定及最适发酵条件研究。 生防菌在植物体内的有效定殖是其控制植物病害的关键，因此，明确生防菌的定殖特性是揭示其生防机制和评价其应用潜力的重要依据。而目前关于人参内生菌的定殖及人参黑斑病田间生物防治研究还未见报道。本课题组从人参茎部分离获得了1株对人参主要病害病原菌具有较好抑菌活性的内生细菌菌株NJ13，经鉴定为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus，明确了最适发酵培养条件[6]。为进一步挖掘NJ13菌株的生防潜力，本研究拟对菌株在人参体内的定殖特性及其对人参黑斑病的田间防治效果进行分析，为开展该菌株更为广泛的生物防治及相关研究奠定坚实的基础。 1 材料 1.1 供试菌株及培养基 供试生防菌株NJ13 B. methylotrophicus，由本课题组分离获得；人参黑斑病菌A. panax由吉林农业大学植物病理实验室提供。 NJ13按常规方法在NA（牛肉膏蛋白胨培养基）上繁殖保存，其发酵培养基为葡萄糖3%、可溶性淀粉1.5%，酵母浸粉1.5%，K2HPO4 0.1%，NaCl 0.5%，起始pH 8.0；靶标菌在常规PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）上繁殖保存。 1.2 试验药剂 利福平（rifampicin， Rif）和硫酸链霉素（streptomycin sulfate， Stre），购于北京鼎国生物技术有限公司，分别使用甲醇和无菌水溶解。50%嘧菌环胺WG购于先正达中国投资有限公司。 2 方法 2.1 NJ13菌株发酵液的制备 将NJ13菌株划线接种于NA平板培养基上，28 ℃培养2 d。待菌落长好后用直径1 cm的打孔器打取2块菌碟，接种于灭菌的LB培养液（胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 L，pH 7.4）中培养10 h，制备成发酵种子液，4%的接种量接