细胞生物学离心技术.ppt

亚细胞成分在蔗糖和渗透压中的密度 例如：1. 线粒体、溶酶体和过氧化物酶体的分离 特征：密度差别、大小类似 选择：等密度梯度离心 例如：2. 细胞核分离纯化 特征：密度、大小差别 选择：高密度蔗糖的差速离心 5.分离细胞器的鉴定和评价 （1）形态鉴定：光镜或电镜 （2）生化分析：细胞器特异的标志酶 * cell fractionation and centrifuge 细胞结构成分的离心分离 Centrifugation is a common separation technique that accomplishes separation based on the the density and size differences in a mixture of components. 沉降系数（S）：颗粒在单位离心力的作用下的移动速度 相对离心力（RCF）：同一颗粒在离心时同地球 重力相比较后得到的值。 RCF(g)=离心力/重力 与颗粒大小、密度有关； 与溶液介质密度和粘度有关。 RPM（rounds per minute): 转速，转头每分钟旋转的次数。 RCF与转速及旋转半径正相关 离心时间：颗粒经过水溶液形成沉淀所需要的时间 离心时间由离心效力和沉降系数决定 各种细胞成分的颗粒密度与沉降速度 Density (g/ml) 二.离心方法 1.差速离心法 2.沉降速度离心，又称移动区带离心 3.沉降平衡离心，又称等密度梯度离心 ? 密度梯度离心法 1.差速离心法 （Differential centrifugation) 原理： 通过一系列递增速度的离心，依次将大小不同的颗粒逐级分离。 大小颗粒 混合物 最大颗粒 较大颗粒 中等颗粒 小颗粒 上清 上清 上清 上清 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞结构成分 沉降顺序： 核—线粒体—溶酶体与过氧化物酶体—微粒（内质网与高尔基体微粒） 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行纯化。 特点： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心； 优点：操作简单；倾倒法即可将上清液与沉淀分开 缺点是：须多次离心，沉淀不纯，分离效果差，沉淀受挤压，易变性失活。 Density gradient centrifugation (密度梯度离心法) 主要是根据被分离颗粒的密度差异。只要被分离颗粒间的密度差异大于1% 就可用此法分离。 优点是: 分离效果好，获得较纯颗粒；适应范围广，既能分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 缺点是：离心时间较长；需要制备惰性梯度介质溶液；操作严格，不易掌握。 2.移动区带离心法 （moving-zone centrifugation) 原理： 用梯度蔗糖（1.28 kg/cm3 ）或甘油作为介质，将要分离的样品放在介质表面，形成一个狭带，然后超速离心，使不同大小的颗粒以不同的速度向管底方向移动，形成一系列区带，从管底小孔中分次收集各种颗粒成分。 用途： 分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 特点： 介质为密度梯度溶液，且密度较低，介质 的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小 密度( ?p ? m )。 必须注意离心时间(t)，不能使所有颗粒都 沉到管底。 分离介质对被分离的物质必须是中性无害的 3.等密度离心法 （isodensity centrifugation) 原理： 离心时采用包括各种颗粒密度范围的梯度介质，被分离颗粒达到与其相同的密度介质时不再移动，形成一系列区带，然后从管底收集。 等密度离心法 由于 CsCl 可自行形成密度梯度（1.65 kg/m3, 底部为 1.75 kg/m3 ）, 所以不必特别制备密度梯度 , 只要将待分离的样品与之混匀即可。在离心的过程中, 具有不同密度的颗粒随 CsCl 密度梯度的形成重新分配, 所以又称为浮力密度离心 用途： 分离密度不等的颗粒，适用于病毒、DNA、RNA、蛋白质等。 特点： 介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应 大于被分离组分的最大密度( ?p ?m ) 。 所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍， 往往需要高速或超速离心