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陕西杨凌地区TYLCV病毒生物信息学研究探究 　　摘 要：采集杨凌五泉、揉谷和李台3个番茄主产区表现矮化、黄化及曲叶症状的植株嫩叶，克隆番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）基因全长并测序，依次得到病毒分离物TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3和TYLCV-SXYL4。通过多序列比对、系统发育树构建及蛋白质结构和理化性质预测等生物信息学方法进行基因组和蛋白质的特征分析，结果表明，杨凌区3个TYLCV分离物之间全长核苷酸相似度为99.3%～99.4%，是不伴随卫星分子的单组分病毒，属TYLCV-IS株系的不同分离物，全长为2 781 nt；与山东寿光病毒分离物TYLCV-SDSG亲缘关系最近，相似度为99.6%，与陕西泾阳的分离物TYLCV-SX8相似度为99.1%，与以色列株系TYLCV-IS相似度达97.7%～97.8%；编码6个蛋白质，其中CP、Rep、REn为跨膜蛋白，V2、TrAP、C4为胞内蛋白，Rep和REn为稳定蛋白，CP、V2、TrAP、C4为不稳定蛋白。 关键词：番茄黄化曲叶病毒；杨凌；番茄；生物信息学分析 中图分类号：S436.412.1+1 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2014）04-0054-07 番茄（Solanum lycopersicum L.）是世界上最重要的蔬菜作物之一[1]，而番茄黄化曲叶病（Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD）为全球番茄生产中最具威胁的“植物癌症”[2]，1961年以色列最先鉴定的番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是其主要病原。TYLCV为单链环状DNA病毒，属于双生病毒科（Geminiviridea）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），由烟粉虱（Bemisia tabaci）以持久性方式传播[3，4]，在寄主细胞核内形成的双链DNA复制中间体共编码6个开放阅读框。杨凌区是我国唯一的农业高新技术产业示范区，位于陕西省关中平原中部，2011年杨凌暴发的TYLCD已成为限制杨凌区番茄生产的主要因素，但目前未见有杨凌TYLCV全基因组分子特征及编码蛋白生物信息学分析的研究报道。本试验对杨凌区五泉、揉谷和李台的番茄主产区进行调查采样，对病毒分离物进行全长克隆、测序和变异分析，并对病毒编码蛋白质的氨基酸序列和蛋白质跨膜结构、不稳定系数等性质进行了比较分析，旨在进一步明确陕西杨凌番茄黄化曲叶病毒基因组结构和进化起源，为进一步开展番茄黄化曲叶病的防控工作、番茄分子抗病育种、病毒变异进化和病毒编码蛋白质结构功能研究提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料与试剂 ①毒源样品 在陕西省杨凌区五泉、揉谷和李台的番茄主产区采集表现生长迟滞矮化、上部叶片黄化、叶片边缘向上卷曲、褶皱簇状、后期不能正常开花结果症状的番茄植株嫩叶各1份，常温下用采样袋密封带回，液氮速冻后置于-80℃保存。 ②试剂 Pfu DNA Polymerase购自Fermenents公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）购自Bioteke公司，质粒微量提取试剂盒购自BIOMIGA公司，PrimeSTAR Max DNA Polymerase、加A尾试剂盒A-Tailing Kit、克隆载体PMD18-T和DH5α感受态大肠杆菌购自TaKaRa公司，试验所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列测定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。 1.2 试验方法 ①植物总DNA的提取和病毒分子鉴定 DNA的提取用CTAB法，得到的样品DNA溶液于-20℃保存备用。TYLCV鉴定用李常保等[5]设计的TYLCV特异引物TYLCV-F/TYLCV-R；阳性对照TYLCV-SH2由浙江大学周雪平教授馈赠。DNA-B组分鉴定用双生病毒DNA-B组分鉴定通用引物PCRc1/PBLv2040[6]；卫星DNA β鉴定用双生病毒卫星DNA β鉴定通用引物Beta01/Beta02[7]，引物序列和目标条带大小见表1。 ②分子克隆和测序 用TYLCV特异引物TYLCV-F/TYLCV-R，Pfu DNA Polymerase扩增部分片段（约500 bp）后回收，用A-tailing Kit加A尾后克隆至PMD18-T载体，转化入DH5α感受态大肠杆菌，经氨苄抗性筛选、菌液PCR鉴定及提取质粒酶切验证后用于测序。依据测得的519 bp序列用Primer Premier软件（Version 5.0，Premier，Canada）设计相邻背向引物SX-F/SX-R，用PrimeSTAR Max DNA Polymerase扩增病毒基因组全长，经克隆并测