一种简单有效的检测基因表达产物的方法.doc

pigment systems in spinach chloroplasts. Biochim Biophys Acta , 1969 , 189 : 171～181 9 Garab G , Kieleczawa J , Sutherland J C , et al . Organisation of pigment2protein complexes into macrodomains in the thylakoid mem2 branes of wild2type and chlorophyll b2less mutant of barley as revealed by circular dichroism. Photochem Photobiol , 1991 , 54 : 273～281 (1998207223 收稿 ,1998211223 收修改稿) 一种简单有效的检测基因表达产物的方法 许家喜 ① 密 ② 远 ③ 林忠平 ② 麻 麻 ( ①北京大学化学与分子工程学院 ,北京 100871 ; ②中国科学院植物研究所 ,北京 100093 ; ③清华大学化学系 ,北京 100084) 摘要 外源基因转入动植物细胞后在翻译水平上正确表达产物的定性定量测定是基因工程中 的重要问题. 通常生物中某些酶的含量很低 ,如异戊烯基转移酶 ,在进行其转基因研究时较难 测定. 根据其 cDNA 序列 ,预测出抗原位点肽并用固相法合成 ,与载体蛋白偶联后获得对其起 专一性反应??抗体 ,用该抗体通过 EL ISA 法可以有效测定转基因烟草中的基因表达产物. 为 测定难以分离纯化的低含量的基因表达产物提供了一种简便而有效的方法. 关键词 转基因植物 异戊烯基转移酶 抗原肽 检测方法 外源基因转入动植物细胞后是否能够在翻译水平上正确表达 ,表达的量如何 ,是基因工程 中至关重要的问题. 翻译水平上的检测 ,虽然可以通过 Western blot 和 EL ISA 等方法进行定性 和定量分析1 ,但对于一些编码生物体内原本含量很微的酶的基因而言 ,获得它们的纯化的表 达产物十分困难. 本文报道一种在计算机辅助下根据 cDNA 序列预测出其抗原位点肽 ,用固 相法合成后制成复合抗原 ,免疫家兔后获得专一性抗体 ,再通过 EL ISA 和 Western blot 法测定 转基因植物中外源基因表达产物的一种简便而有效的方法. 1 材料与方法 (1) 试剂和材料. 保护氨基酸 Boc2His ( Tos) , Boc2Arg ( Tos) , Boc2Ile , Boc2Ala , Boc2Glu (Obzl) , Boc2Lys ( Z) ,Boc2Phe , Boc2Gln ,氯甲基树脂 ( 含氯量 1104 mmol/ g , 1 %交联度) , HOBt , HOSu 和三氟乙酸 ( Sigma 公司) ,Sephadex G15 ( Pharmacia 公司) ,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG ( HRP2羊抗兔 IgG) (华美公司) ,其他试剂为国产分析纯. 烟草 ( Nicotina tobacco W38) 无菌 苗继代培养于 MS 培养基中 ,取其叶片和茎段作为转基因受体而得到的转基因植株. (2) 仪器. IBM PC586 计算机 ;手工固相多肽合成仪 ;L KB2151 高压液相色谱仪 ,柱 XWG2 C18 (4 . 6 mm ( I. D. ) ×250 mm) ; Hitachi 835250 型氨基酸分析仪 ; Perkin2Elmer 241 MC 旋光仪 ; EL ISA Reader G4500 Bio2Rad 酶标仪. 核酸蛋白紫外检测仪 ,Bruker Instrum Biflex Ⅲ质谱仪. 预测出的抗原肽用固相法合成2 ,3 ,先将 0 . 53 g (2 mmol) Boc2Phe 与 (3) 抗原肽的合成. 0 . 33 g (1 mmol) 碳酸铯反应制成铯盐 ,再连到 0 . 5 g (含氯 0 . 52 mmol) 固相载体氯甲基树脂上 , 用无水乙酸钾 、苯甲酰氯依次封闭 ,30 %三氟乙酸/ 二氯甲烷脱保护 ,三乙胺中和 ,茚三酮法测 得氨基含量为 0135 mmol (0 . 70 mmol/ g) ,按预测出的抗原肽序列 ,以 1 mmol 保护氨基酸为原 料 ,HOBt 或 HOSu 和 DCC 为缩合剂 ,用逐步接长法依次接至所需肽段. 合成好的肽段以苯甲 乙醚洗涤 ,30 %乙酸提取 ,冻干后用 Sephadex G15 凝胶过滤 ,以 1 mol/ L