细胞分子生物学（扬州大学）第十章 克隆DNA鉴定.pptVIP

第十章DNA克隆的鉴定与应用 第一节 克隆DNA的鉴定 一、 鉴定内容 DNA纯化：是克隆DNA鉴定的前提 鉴定内容：包括插入片段的大小、限制酶切图谱、是否为转录序列、基因的位置及方向、基因完整性、部分或全部序列测定等 序列测定：目前DNA序列测定效率已很高，在获得DNA克隆后，第一步往往是进行序列测定，然后用电子计算机软件对所获序列进行分析，以获得基因大小、限制酶切图谱、阅读框及其方向等信息 基因验证：根据电子计算机软件分析获得的基因，有时有必要用实验证实其能否在细胞中表达正确的蛋白质 二、限制酶图谱分析 DNA制备： 质粒文库：用碱性溶解法从单个菌落的液体培养物中提取 噬菌体文库：挑取单个噬菌斑，感染大肠杆菌，培养后离心去除溶解细胞碎片，用离心法或PEG沉淀法回收细胞裂解液中的噬菌体颗粒，再用酚抽提和酒精沉淀获得噬菌体DNA 限制酶消化：选择适当的限制酶进行完全或不完全消化，将消化产物与标准分子量marker同时进行电泳。所获信息有助于重组DNA分子酶切图谱的描绘，但难以提供载体中插入片段的方向以及片段之间的顺序等信息，往往需用不同限制酶的组合分析才能确定 三、核酸探针标记 四、核酸杂交 分类： Southern杂交：根据发明者姓氏命名，用于DNA检测 Northern杂交：原理与Southern杂交相同，用于RNA检测 斑点杂交：不需电泳分离,用于DNA和RNA定性检测 基本程序： 电泳分离：琼脂糖凝胶电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳（小分子核酸） 核酸转印：毛细管转移法，经济、速度慢（过夜）；电转移法，快速，需专用转印仪 交联固定：紫外线交联，烘烤法 预杂交：在不含标记探针的杂交液中杂交 杂交：在含标记探针的杂交液中杂交 洗膜与信号显示：显色法，化学荧光法，放射自显影 五、DNA序列测定 常用方法：Sanger等（1977）提出的酶法，Maxam和Gilbert（1977）提出的化学降解法，前者更常用 基本原理： 先产生互相独立的若干组放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或多种残基 由于DNA上的每一碱基出现在可变终止端的机会均等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定 然后在可以区分仅一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道这上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序 七、序列分析 DNA序列分析必须借助电子计算机分析软件，常用的有GCG软件包和Lasergene软件包 GCG软件包：最早由University of Wisconsin-Madison，Genetics Computer Group（GCG）开发，为综合序列分析软件包，安装在基于Unix系统的服务器上，用户可通过网络连接使用其分析程序及数据库，包括130多个独立的序列分析程序，可分成12个类别：1、Sequence Comparison：序列比较分析2、Database Searching and Retrieval：从数据库中搜寻与获取序列资料 3、DNA/RNA Secondary Structure Prediction：核酸二级结构预测4、Editing and Publication：序列编辑与发表5、Evolutionary Analysis：序列进化（同源性）分析6、Fragment Assembly：核酸片段组装7、Gene Finding and Pattern Recognition：基因寻找与模式识别8、Importing and Exporting：序列输入与输出9、Mapping：图谱分析10、Primer Selection：PCR引物设计11、Protein Analysis：蛋白质序列分析12、Translation：序列翻译 Lasergen软件包：由DNASTAR公司开发,可在计算机上进行小规模序列分析和多序列比较，主要有7种分析程序和功能：1、Editseq：序列输入和编辑2、PrimerSelect：PCR引物和探针设计3、MapDraw：限制性酶切位点分析和图谱绘制4、MegAlign：多个和成对蛋白或DNA序列比对分析5、GeneMan：生物数据库和数据库检索6、Protean：蛋白结构分析7、SeqMan：序列装配和毗连(序列)群管理 第二节 多聚酶链式反应(PCR) 一、基本原理 PCR是将一对寡核苷酸引物与变性的DNA分子退火，以DNA聚合酶对引物进行反复延伸，从而使目标片段得到大量扩增的一种聚合反应 热稳定DNA聚合酶的发现使得PCR操作更加方便，已成为分子生