向日葵V-ATPasea3亚基基因的克隆及表达分析-生物通.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３７（５）：１９２７ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 向日葵ＶＡＴＰａｓｅａ３亚基基因的克隆 及表达分析 １ ２ ２ １ 张艳芳 　孙瑞芬 　郭树春 　侯建华 （１内蒙古农业大学农学院　呼和浩特　０１００１９　２内蒙古农牧业科学院　呼和浩特　０１００３１） 摘要　采用ＲＡＣＥ技术，从向日葵Ｐ５０中克隆ＶＡＴＰａｓｅａ３亚基基因ｃＤＮＡ全长，并进行生物信 息学分析；利用实时荧光定量ＰＣＲ分析不同浓度、不同时间的ＮａＣｌ、ＡＢＡ和ＰＥＧ模拟干旱胁迫条 件下ＶＡＴＰａｓｅａ３亚基基因的表达特征，以及相同胁迫条件下该基因在向日葵不同器官的表达特 征。序列分析表明，该基因 ｃＤＮＡ全长 ２８７３ｂｐ，含 ５′ＵＴＲ１０９ｂｐ、３′ＵＴＲ２９５ｂｐ及编码区 ２４６９ｂｐ，编码 ８２２个氨基酸，其编码蛋白质的理论分子质量为２０４．５５ｋＤａ，等电点为６．２９， ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＫＵ３１５０５４。该基因编码的蛋白质为疏水性的跨膜蛋白，亚细胞定位预测其在 质膜上。向日葵ＶＡＴＰａｓｅａ３亚基与已报道的１０种植物的ＶＡＴＰａｓｅａ３亚基的同源蛋白有高度 相似的保守区域，在进化上与朝鲜蓟的亲缘关系最近。实时荧光定量ＰＣＲ结果表明，向日葵受到 ＮａＣｌ、ＡＢＡ和ＰＥＧ模拟干旱三种非生物胁迫后，ＶＡＴＰａｓｅａ３亚基基因均上调表达，但表达模式不 同，不同器官存在特异性表达差异。研究认为，ＶＡＴＰａｓｅａ３亚基基因响应了向日葵非生物胁迫 的应答，为加强对ＶＡＴＰａｓｅ基因的利用奠定基础。 关键词　向日葵　ＶＡＴＰａｓｅａ３亚基　基因克隆　序列分析　基因表达 中图分类号　Ｓ５６５．５ 　　盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一，土壤 ＡＴＰ酶，命 名为液泡 （ｖａｃｕｏｌａｒ）ＡＴＰ酶，简称 为 中过多的可溶性盐会使植物吸收水分的能力受限，使 ［２］ ＶＡＴＰａｓｅ 。ＶＡＴＰａｓｅ或称为Ｖ型泵（Ｖｔｙｐｅｐｕｍｐ）， 植物在形态、生理、生化上发生改变，从而导致植物生 广泛分布在真核生物细胞原生质膜和细胞器（高尔基 长受阻。植物的抗盐性是指克服土壤高离子浓度造成 体、溶酶体、内膜体和分泌颗粒等）的内膜系统中，在植 的渗透胁迫和离子本身产生的毒害，在盐渍环境中生 物细胞中主要存在于液泡膜上。ＶＡＴＰａｓｅ利用水解细 长和发育。植物对盐胁迫的反应形式多种多样，其中 ＋ 胞质中ＡＴＰ产生的能量将细胞质中的Ｈ 泵入液泡，建 ＡＴＰａｓｅ在胞内离子转运和植物抗盐过程中发挥着重要 立跨液泡膜的质子驱动力（ｐｒｏｔｏｎｍｏｔｉｖｅｆｏｒｃｅ，ＰＭＦ）， ［１］ 作用 。ＡＴＰａｓｅ，又称为三磷酸腺苷酶，是一类能将三 从而驱动溶质在细胞质和液泡间跨液泡膜转运，维持 磷酸腺苷（ＡＴＰ）催化水解为二磷酸腺苷（ＡＤＰ）和磷酸 ［３］ 细胞质溶质等相对恒定，保证生命活动的正常进行 。 根离子的酶。植物细胞膜上的ＡＴＰ酶有３类：分别是 ＶＡＴＰａｓｅ基因因其在生命活动中的重要性和实际意 位于细胞膜上的Ｐ型 ＡＴＰａｓｅ、位于液泡膜上的Ｖ型 ＋