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第 14卷第 5期2 0 1 4 年 5 月中 国 食 品 学报JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnologyVol． 14 No． 5May 2 0 1 4鱼类肠道嗜酸乳杆菌的分离及功能特性分析王琳珺1潘道东1，2*杨媛1吴振2曾小群1（1 宁波大学海洋学院食品系 浙江宁波3152112 南京师范大学食品系 南京210097）摘要以不同来源的鱼肠内容物为原料，采用改良MRS培养基进行培养，分离到28株乳酸菌疑似菌株。利用 生理、生化和分子生物学手段，从28株疑似菌株中鉴定出2株嗜酸乳杆菌D1和B3。通过DPPH清除率试验， 从2株目的菌株中选取较高清除率的菌株D1做进一步研究。结果表明D1是1株具有高抗氧化能力，并对新 霉素、菌必治、丁胺卡那霉素、庆大霉素等常见药物有一定耐药性的优良嗜酸乳杆菌。关键词 鱼肠； 嗜酸乳杆菌； 分离鉴定；功能特性分析文章编号1009-7848（2014）05-0020-06嗜酸乳杆菌作为1种重要的肠道益生菌，在 调节肠道微生物菌群，增强机体免疫力及预防肿 瘤等疾病中具有重要作用，并日益成为食品科学 的研究热点[1-2]。基于哺乳动物肠道中的乳酸菌属于优势菌群，目前国内外学者大多从哺乳动物的肠道中分离嗜酸乳杆菌。近年研究发现，鱼类（尤其是植食性鱼）肠道中也存在嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、棉籽糖乳球菌等多种乳酸菌类群[3]。若能将大量的废弃 鱼肠作为嗜酸乳杆菌菌源的获取渠道，将对嗜酸乳杆菌这一第3代发酵剂的开发提供有力的支撑。 现阶段针对嗜酸乳杆菌的鉴定普遍采用传统的生理、生化试验方法，然而该方法对乳杆菌属内 种间的表型特征难以区别，无法给出准确的鉴定 结果。随着分子生物学技术的发展，从分子和基因水平来分析乳酸菌的遗传结构和进化分类已成为有效的鉴定手段。细菌16SrRNA基因核苷酸序列具有高度的保守性，而在保守区间存在9～10个 可变区，不同的属、科、种都有一定的变异，基于这一特性，利用16SrRNA的同源性分析对细菌进收稿日期： 2013-05-20行鉴定是1种高效且准确的鉴定方法[4-5]。Sul[6]等 根据16SrRNA及16S-23SrRNA的不同设计了4对特异性引物，做多重PCR，结果从益生菌制品中快速鉴定出嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌和两歧双歧杆菌。Yu-LiSong[7]等采用多重PCR法从人体肠道中快速检测出发酵乳杆菌、嗜 酸乳杆菌、格氏乳杆菌等84株乳酸菌。以上研究说明采用生理、生化与分子生物学结合的方法鉴 定菌株，可以最大程度地确定细菌的种属特征。采用溴甲酚紫作为固体培养基指示剂筛选产酸菌株，然后利用生理生化、PCR双重鉴定以及系 统发育树的同源性分析手段，快速筛选优良的嗜 酸乳杆菌，并研究该菌株的抗氧化能力、生长情况及耐药性。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1试验原料新鲜淡水鱼（白鲢、花鲢、草鱼） 和新鲜海水鱼（带鱼），购于宁波市路林市场。从这些鱼肠中分离所需乳酸菌菌株。1.1.2培养基普通MRS固液培养基：配制参考孙涛[8]方法。基金项目：国家自然科学基金项目；浙江省自MRS-溴甲酚紫固体培养基[9]：在普通液体然科学基金重点项目（Z3110211）；宁波市攻关项目（2011C11017）作者简介：王琳珺，女，1989年出生，硕士生通讯作者：潘道东MRS培养基（每1000mL）中加入1.6%溴甲酚紫-乙醇，调节pH7.2～7.4。1.1.3主要试剂阿拉伯糖、葡萄糖酸盐、山梨第 14 卷 第 5期鱼类肠道嗜酸乳杆菌的分离及功能特性分析21醇、核糖、甘露醇、乳糖、水杨苷、七叶苷、海藻糖、 纤维二糖，阿拉丁有限公司；细菌DNA鉴定试剂盒，OMEGA公司；药敏纸片，杭州微生物试剂有限公司。1.2 仪器与设备TC9600-G-230V型梯度PCR仪，Labnet公 司；JY-SPC型水平电泳仪，北京六一仪器厂；HWS 智能型恒温恒湿培养箱，宁波江南仪器厂。1.3 方法1.3.1样品前处理剖杀新鲜鱼，无菌打开鱼肠， 从中取3g内容物于离心管中，用灭菌生理盐水稀 释至10倍，摇床振荡10min。取上清液，按1%比 例接种于MRS液体培养基，37℃厌氧培养12h。 1.3.2菌种的分离纯化将培养液进行10倍系列梯度（10-1～10-8）稀释，分别蘸取10-6～10-83个稀释度的溶液100μL涂布于MRS-溴甲酚紫固体平板中，在37℃培养箱中恒温培养24h，挑取单个黄色菌落，纯化，备用。1.3.3革兰氏镜检挑取所有纯化的菌落进行革兰染色，镜检，观察菌体形态。1.3.4生化反应鉴定将镜下呈单个、成对或链状排列的杆菌进行明胶液化，过氧化氢酶、硝酸盐还原反应试