嗜热古菌高温酸性淀粉酶基因合成和大肠杆菌中的表达 Gene Synthesis and Expression of Thermoacidophili a-amylase in Escherichia coli.pdfVIP

嗜热古菌高温酸性淀粉酶基因合成和大肠杆菌中的表达。 柯 涛1，熊 兰2，石晴芳2，马向东2 1(南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳，473061)2(湖北大学生命科学学院，湖北武汉，430062) 擒要 BD5088是来源于1种嗜热球菌Thermococcus sp．的高温酸性r淀粉酶的人工突变体，研究中根据 BD5088基因的氨基酸序列·经密码子优化，用2步PCR法合成去信号肽后的成熟肽基因。该基因全长1311 出的目的蛋白分子量约为48 ku，大小与理论值一致，经过Ni+树脂纯化，得到纯化后的重组酶BD5088。重组旷 酶活性半衰期约30 rain。活性不依赖于Ca2+。本研究为该基因在毕赤酵母中的表达和基因的定向进化改造打 下了基础。 关键词 高温酸性旷淀粉酶，基因合成，表达，酶学性质 a一淀粉酶为内切型淀粉酶，能够以淀粉为底物， 温酸性淀粉酶的研究也大多集中在这个基因的表达 从淀粉内部水解1，4一a—D一葡萄糖苷键。耐高温淀粉 上。但现有基因还不能满足生产的要求。因此，进一 酶更广泛应用于淀粉加工、制糖、味精、酒精等发酵工 步开发嗜热古菌淀粉酶基因资源是首先要解决的问 业LlJ。发酵工业中对淀粉原料的加工工艺现广泛使 题。 用双酶法，a一淀粉酶需要与糖化酶配合使用，依次对 淀粉原料进行液化和糖化处理。液化过程现广泛采 到的一系列可能来源于1种嗜热球菌属(Thermo- 用喷射液化，淀粉大颗粒经喷射液化器，在105～ COCCUS)的高温酸性a一淀粉酶基因，并通过定向进化筛 选到一个高温酸性n一淀粉酶的人工突变体BD5088， 110℃的高温下胶化，淀粉糊的自然pH值为3．5～ 在荧光假单胞菌Pseudomonas 4．2，目前淀粉加工过程需要将pH值调到6．0～ 6．2，在糖化过程中，糖化酶的最适作用温度、pH等达[sJ。该基因全长1311bp，编码436个氨基酸，蛋白 均与淀粉酶不同，因此在淀粉液化和糖化过程中需要 质的理论分子质量约48ku，肽链上不存在任何潜在 反复用酸碱调整pH值，这样不仅提高了浆液中的离 N一连接糖基化位点。最适pH4．5，最适温度95℃， 子浓度，而且调节不当会产生大量的副产物，影响发 活性不依赖于Ca2+存在，是一种高温酸性a一淀粉酶， 酵效率，增加了后续工艺的复杂程度。因此现行淀粉 从热稳定性、最适pH和最适温度等酶学特性综合比 加工工艺迫切要求开发一种最适pH值与糖化酶 较，其综合性质均优于其它突变体基因，具有较大的 (pH4．2--一5．0)相仿的高温酸性a一淀粉酶，以简化工应用潜力。为了能达到生产的目的，和对该基因进行 业流程、节省生产成本，减少环境污染口’3]。 进一步的定向进化研究，本研究首先利用2步PCR 对耐热淀粉酶的研究目前以嗜热古菌淀粉酶基 法人工合成经过密码子优化BD5088基因，采用特殊 因为研究热点，因为它们能在酸性环境、80～110℃的处理矫正基因合成过程中的碱基突变。该基因在大 环境下生长良好，产生的耐热酶在高温和酸性条件下 肠杆菌中进行表达，验证其酶学性质。为进一步的酵 具有很好的稳定性，而细菌来源的淀粉酶无法满足 母系统表达及该基因的定向进化筛选奠定基础。 pH的要求。目前已发现来源于嗜热古菌的a一淀粉 1材料和方法 酶基因已有30多个[引，但并不是所有基因都能符合 现行工艺要求，其中只有来自Pyrococcus 1．1材料 furiosus 的高温酸性淀粉酶基因得到深入的研究‘引，国内对高 1．1．1 菌株与质粒 大肠杆菌(Escherichia 第一作者：博