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生物分子及天然产物的分离纯化原理及应用
Chromatography Techniques 为何选择层析作为生物分子及天然产物纯化方法？ 不产生热 不产生外力 高回收率 高分辨率 线性放大，可预期 可自动化 大量成功例子 Principles of Operation for Chromatography Techniques 齐备的硬件支持系统 层析介质：数百种层析填料 层 析 柱： 直径4.6~2000mm 色 谱 仪： ng~Kg的制备产量 色谱软件：Unicorn 色谱工作站 ?KTA? - 一个全面的纯化平台 Laboratory Separations Systems 1995 - 2005 ?KTA explorer 快速工艺开拓系统 全自动峰收集 AKTA层析设备的应用 AKTA--专门分离和纯化各类生物分子 纯化蛋白质 (天然, 重组及融合蛋白) Refolding by Chromatography PEG-IFNa-2a ?发酵液—收集菌体—破菌—SrFF离子交换—IFN单抗柱纯化—S100分子筛—纯品 PEG修饰反应 修饰后纯化： 分子筛(Superdex-75) 或 离子交换层析 PEG-IFNa-2a 用 HiTrap IgM 柱从细胞培养上清液一步纯化单抗 IgM 在AKTAprime 上用 HiTrap Desalting 柱脱盐 纯化肽类, 寡核苷酸 Tα-1 on FPLC, 离子交换柱 Column: AIEX (阴离子交换柱） Buffer A: 0.05M Tris-HCl , pH7.5 Buffer B: 0.05M Tris-HCl+1MNaCl 分离后HPLC鉴定 Column: ODS Hypersil C18(4.6x200) Gradient: 3-23min 20-60% Superdex Peptide --肽纯化的新选择 合成 DNA 寡核苷酸的纯化 纯化疫苗(病毒), 质粒 First approved gene therapy product in the world – Ad-p53 重组人p53腺病毒注射液 Gendicine(今又生TM) Shenzhen SiBiono Approved by SFDA Oct 2003 晚期鼻咽癌的治疗 BioPharm May 2004 Purification of adeno virus specific process Purification of supercoiled pDNA 纯化天然产物 纯化工艺的技术选择 1.离子交换层析 阳离子交换纯化生物碱 阴离子交换纯化生物酸 阴离子交换纯化甙类 2.反相层析应用 分离甙类、生物碱、有机酸 离子交换与中压反相配合 3.逆流色谱技术 4.Sephadex LH 20层析 5.正相层析 离子交换除色素 河豚鱼毒素 仪器：AKTAexplorer 100 Air with Frac 950 柱子：FineLINE 35 Polit 介质：Source 15RPC Polysaccharides 多糖 TCM纯化工艺的放大 线性放大 ?KTA? explorer10 BioProcess MPLC 10mm System ＋ 2 Sets FineLINE 350 Column THANK YOU! 二、紫衫醇正相生产工艺的改造 cm/h = ml/min x 60 cm 2 固定以下条件 1. 相同线行流速 2. 相同缓冲液 3. 相同填料 4. 相同柱高 5. 相同样品浓度和pH 6. 相同样品体积和柱床体积比例 7. 相同梯度体积和柱床体积比例 放大 1. 柱直径 2. 体积流速 3. 上样体积 2.0 1.0 0 0 1 2 3 4 5 6 (column volumes) A 280 nm 2.0 1.0 0 0 1 2 3 4 5 6 (column volumes) A 280 nm SOURCE 30RPC FineLINE 200L 400-fold scale up 10 mm diameter column Column: SOURCE 30RPC, a) 10x300 mm (23.6 ml) b) FineLINE 200L, 100x300 mm
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