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酵母双杂交技术检测相互作用的蛋白质 1. 基本原理 2. 功能应用 3. 基本流程 4. 发展延伸 基本原理 真核生物中都含有反式作用因子和顺式作用元件，调节基因的表达。 不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。 酵母双杂交系统由三个部分组成 目前酵母双杂交实验采用的有LexA 系统和Gal4 系统两种。 LexA系统：DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则是大肠杆菌多肽B42 构成。 Gal4 系统中： BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域构成。 系统优点 是在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天然的折叠状态。 双杂交系统的敏感度高。 在筛选cDNA 文库时，双杂交系统能够简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列。 系统局限性 1.假阳性问题 2.假阴性问题 3.转化效率偏低 功能应用 检验一对功能已知蛋白间的相互作用。 研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结域。 用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库 分析新基因的生物学功能。 酵母双杂交系统的组成 1. 载体质粒： pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库 2. 酵母菌株： EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM42 3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株 4. 对照质粒： pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照 pLexA-Pos (LexA/GAL4 AD融合蛋白〕 阳性对照 pLexA-Lam (LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性 检测质粒 5. 引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。 筛选标志 1.质粒p8op-LacZ因筛选标志为URA3 2.质粒pLexA的筛选标志为HIS3 3.质粒pB42AD的筛选标志为TRP1 基本流程 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。 同时构建或扩增DNA文库。 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵。 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。 转化质粒 选择培养基 克隆生长情况 说 明(含有Gal/Raf)? ? pLexA-Pos SD/-His， -Ura 蓝 阳性对照 pLexA SD/-His，-Ura 白 阴性对照 PlexA-X SD/-His，-Ura 白 没有直接活 PlexA-X SD/-His，-Ura 蓝 具有直接激活 PlexA-X SD/-His，-Ura 菌落不能生长 酵母细胞毒性 5检测质粒转化效率。 转 化 质 粒 SD固体培养基 LacZ表型 对照1 pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura 蓝 对照2 pLexA-53 Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 蓝 ＋pB42AD-T ? ? 实 验 pLexA-X Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 待测 ＋pB42AD-文库? ? 5.1 用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增. 5.2 上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形. 5.3 将蓝色阳性克隆进行1次以