真核细胞DNA提取与酶切鉴定 2013.10.10.ppt

DNA的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合链线性分子。 线性DNA分子在电场中的迁移率与其分子量的对数成反比 DNA的空间构型不同，即使分子量相同其迁移率也不相同 核酸电泳的染色剂 最常用的是溴乙锭染色法。 (ethidium bromide，EB) 对1ng RNA，DNA均可显色。 EB染料是一种强烈的诱变剂，操作时应注意防护，应戴上聚乙烯手套。 在紫外线激发下，发出红色荧光(590nm） 。 实 验 结 果 酶切后的基因组DNA 基因组DNA 微量加样器的使用 注意最大量程，两挡之间的关系； 使用时应在量程之内调节，超过量程会损坏加样器 用镊子取枪头（tip头），推出tip头勿用用力过猛 不能将加样器倒置以防液体倒流损坏加样器； 加样器的枪头（tip头）一定要拧紧 离心机的使用注意事项 1、样品平衡，设定离心时间，逐渐升到要求转速。 2、离心管的盖子要盖严，以防液体漏到离心机内； 3、离心管盖子与管的连接端朝向外侧 4、先将转速的旋钮调到最小，再打开离心机盖子，取出离心管。 5、最好8组同时离心，否则更耽误时间 * * 哺乳动物DNA的分离通常是在有EDTA及SDS一类的去污剂存在下用蛋白酶K消化细胞．随后用酚抽提而实现的。低分子量杂质则用透析法加以去除。这一方法获得的DNA，其大小(100—150kb)适用于Southern分析和用噬菌体构建基因组DNA文库。然而，若要用粘粒成功地构建文库则要求更大的DNA。 —端受到剪切而另一端则由限制酶切割产生的DNA片段，可在连接反应中争夺粘粒DNA，从而有效地阻碍了可被包装进曙菌体颗粒的多联体的形成。为避免出现这—问题，初始DNA的长度需数倍于用来构建文库的部分酶切产物。图9．2表示两端均适于克隆的部分消化产物所占组分与基因组DNA的初始长度的相互关系。DNA初始长度应至少是用于克隆的片段的4倍，否则生成的有效片段相对较少。因此，用就粒构建基因组DNA文库，初始DNA的长度应大干200kb。对于涉及有机溶剂抽提和机械剪切作用的方法来说，分离这样大小的DNA片段是困难的，因为在这些步骤里，DNA发生大量丢失。从哺乳动物细胞和组织中分离DNA的三种程序。 * ?SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。 蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物样品中蛋白质的一般降解。从林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中纯化得到。该酶有两个ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶k消化过程中通常加入edta（以抑制依赖于mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶k具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/l ca2+而不含edta的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至终浓度为2mmol/l,以鳌合ca2+。 　　蛋白酶K，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50—100μg/ml。在较广的pH范围内（pH 4-12.5）均有活性。 * 生化实验内容安排 实验室 实 验 内 容 一 实验16：DEAE纤维素离子交换层析 二 实验17：血清-γ球蛋白的提纯 实验8 ：醋酸纤维素薄膜电泳 三 实验9 ：聚丙烯酰胺凝胶电泳 四 实验3 ：测定蛋白质的比色分析法 实验12：血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳 五 实验18：真核基因组DNA的分离提取 六 实验7 ：酶促反应动力学实验 第一轮 第二轮：考试 实验本身: 实验室规则: 时间、穿着、仪器不能乱动、赔偿制度、整洁、卫生。 实验报告（如实记录）规范操作（辨认标签…）、污染物、毒物、废弃物（酸碱烧伤大量自来水冲洗） 实验 实验报告要求 题目，组号 实验目的 实验原理 实验操作：如实记录 实验结果及结果分析：实事求是 讨论或小结：认真分析，仔细思考 * 真核细胞基因组DNA的分离提取及酶切电泳