第四章 沉淀技术.pptVIP

第四章 沉淀技术 第一节 概述 第二节 蛋白质表面性质 第三节 蛋白质沉淀方法 第一节 概述 一、沉淀的概念 沉淀和结晶区别在于形态的不同：同类分子或离子以有规则排列形式析出称结晶；同类分子或离子以无规则紊乱排列形式析出称沉淀。 第二节 蛋白质表面性质 蛋白质的组成、构象及分子周围的环境决定蛋白质的溶解性。选择适当的溶液就能使欲分离的有效成分呈现最大溶解度，而使杂质呈现最小溶解度，或者相反。 一、蛋白质表面的亲水性和疏水性 将决定蛋白质在水相环境中的溶解程度； 二、蛋白质表面的电荷 三、蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质是一有正负电荷的胶体颗粒。蛋白质分子在溶液中的稳定性是以胶粒间的范德华力和胶粒与液体界面存在的电荷斥力平衡为基础的。 1、蛋白质周围的水化层 蛋白质周围存在紧密结合的水化层和疏松结合的水化层。水化层是蛋白质形成稳定的胶体溶液、防止蛋白质凝聚沉淀的屏障之一。 吸附层在相距胶核表面约一个离子半径的Stern(斯特恩)平面以内，阳离子被紧密束缚在胶核表面，称吸附层； 在Stern(斯特恩)平面以外，阳离子在溶液中扩散，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称扩散层。 当蛋白胶体粒子在溶液中作运动时，随其一起滑动的总有一薄层液体，该薄层液体的厚度稍大于吸附层的厚度，该薄层液体的外表面被称为滑移面或剪切面。 双电层的电位 第三节 蛋白质沉淀方法 根据所加沉淀剂的不同可分为： 一、盐析法 二、有机溶剂沉淀法 三、等电点沉淀法 四、非离子型聚合物沉淀法 五、变性沉淀 六、生成盐类复合物的沉淀 七、亲和沉淀 八、SIS聚合物与亲和沉淀 选择方法时，要注意沉淀剂是否会引起蛋白质分子的破坏、沉淀剂本身的性质、沉淀操作的成本和难易程度、残留沉淀剂的去除难度和最终产品的产率及纯度的要求等。 盐析：蛋白质在高离子强度溶液中溶解度降低，以致从溶液里沉淀析出的现象称为盐析。 1）原理 蛋白质在稀溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下渐，直至蛋白质析出（盐析）。 在蛋白质溶液中当盐浓度增加到一定数值时，水化膜逐渐被破坏，使蛋白质脱水，蛋白质所带电荷也逐渐被中和，使颗粒间的斥力失去，在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合聚集成沉淀。 2）常用的盐 盐析用盐的要求：盐析作用要强，有较大的溶解度，必须是惰性的，来源丰富、经济。 可使用的中性盐有硫酸盐、磷酸盐、氯化钠、醋酸钠、柠檬酸钠、硫氰化钾。 盐析机理示意图 溶解度S与离子强度的关系 二、有机溶剂沉淀法 原理：有机溶剂使水溶液的介电常数降低，使蛋白质分子间的静电引力增大，导致凝集与沉淀；可与蛋白质的水化层结合，从而降低蛋白质的溶解度。 常用有机溶剂有丙酮（最佳）、乙醇次之、甲醇更次，工业上乙醇最常用。 四、非离子多聚物沉淀法 1）机理：非离子型聚合物从溶剂中空间排斥蛋白质，使蛋白质浓度增加而产生沉淀。 2）常用试剂：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖等。 3）优点： ①条件温和； ②沉淀完全； ③不易引起蛋白质变性，且可提高其稳定性； 4）缺点：非离子型聚合物难从蛋白质溶液中除去 五、变性沉淀 原理：被分离的目标物质能忍受一些较剧烈的实验条件，而一些杂质却因不稳定而从溶液中首先变性沉淀，从而达到分离出目标物的目的。 变性沉淀包括热变性沉淀和pH值变性沉淀。 六、生成盐类复合物的沉淀 1、与生物分子的酸性功能团作用的金属复合物（如铜盐、银盐、锌盐、铅盐、锂盐、钙盐等）； 2、与生物分子的碱性功能团作用的有机酸复合盐（如苦味酸盐、苦酮酸盐、单宁酸盐等）； 3、无机复合盐（如磷钨酸盐、磷钼酸盐） 七、聚电解质沉淀方法 原理：蛋白质的反电荷与聚电解质结合，形成多分子络合物，超过游离蛋白质的溶解度极限值时，就发生沉淀。 可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚已烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。 六、金属离子沉淀方法 原理：金属离子能与蛋白质分子中特殊部位起反应，使蛋白质的等电点转移，从而降低蛋白质的溶解度。 * 沉淀又称为沉析，指在溶液中加入沉淀剂，改变溶剂和溶质的能量平衡来降低其溶解度，使生化产物离开溶液生成不溶性颗粒，沉降析出的过程。 沉淀与结晶本质属于同一种过程，都是新相析出的过程，主要为物理变化。 二、沉淀的优点 设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产