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天马行空官方博客：/tmxk_docin ；QQ:1318241189；QQ群：175569632 MM_FS_CNG_0269谷物 维生素B2 含量 荧光分光光度法 MM_FS_CNG_0269 谷物维生素B2测定方法 1.适用范围 本标准适用于谷物中维生素B2含量的测定。 2.原理概要 维生素B2（即核黄素）在445nm紫外光激发下产生荧光，在一定浓度范围内其荧光强度与核黄素浓度成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光强度之差与内标荧光强度的比值，计算样品中核黄素的含量。 3.主要试剂和仪器 3.1.主要试剂 荧光分光光度计； 分析天平（感量1mg，0.1mg）； 电热恒温水浴； 具塞玻璃刻度试管，15mL。 3.2.仪器 盐酸:0.1mol／L盐酸溶液：将8.5mL盐酸用水稀释至1000mL； 冰乙酸； 0.02mol／L冰乙酸溶液:将1.8mL冰乙酸用水稀释至1000mL； 无水乙酸钠:或结晶乙酸钠,2.5mol／L水溶液,205g无水乙酸钠或345g结晶乙酸钠溶于水。稀释至1000mL； 高锰酸钾:40g／L水溶液,贮于棕色瓶中，置于暗处。该溶液可保存一周； 过氧化氢:100mL／L水溶液,现用现配； 核黄素标准溶液： 核黄素贮备液Ⅰ：核黄素；于五氧化二磷干燥器中干燥24h，称取0.0500g，溶解于0.02mol／L乙酸溶液中，在蒸汽浴上恒速搅动至溶解，冷却后定容至500mL,盛入棕色瓶加甲苯覆盖，低温（4℃）保存； 该溶液每毫升含0.1mg核黄素； 核黄素贮备液Ⅱ：取核黄素贮备液Ⅰ,10mL，用0.02mol／L乙酸溶液,定容至100mL,盛入棕色瓶中加甲苯覆盖，低温（4℃）保存； 该溶液每毫升含10μg核黄素； 核黄素标准工作液：取核黄素贮备液Ⅱ5mL,用水定容至100mL，现用现配； 该溶液每毫升含0.5μg核黄素； 测定样品前，预先在相同的条件下测定标准工作液的荧光强度，如有异常，需重新配制标准溶液； 荧光素标准溶液： 荧光素贮备液：称取荧光素；0.0500g，用水溶解后定容至1000mL。盛入棕色瓶中，低温（4℃）保存； 该溶液每毫升含50μg荧光素； 荧光素标准工作液：取荧光素贮备液1mL，用水定容至1000mL,盛入棕色瓶中，低温保存； 该溶液每毫升含0.05μg荧光素； 连二亚硫酸钠（Na2S2O4）。 4.试样的选取和制备 选取有代表性的谷物样品（带壳籽粒需脱壳），拣净杂质，按四分法缩减取样。 将样品在60～65℃烘干后粉碎，过60号筛（0.25mm），装入磨口瓶中备用。 5.过程简述 称样：称取谷物样品2～5g（准确至0.001g），约含核黄素5μg。将待测样品置于100mL容量瓶中。 同时称样，按GB 3523—83《谷物、油料作物种子水分测定法》测定样品的水分含量。 制备样液：往盛样品的容量瓶中加75mL盐酸溶液，于沸水浴中加热30min。开始加热的5～10min时常摇动容量瓶，以防样品结块。冷却至室温后，加5mL乙酸钠溶液摇匀，用水定容。该试液的pH为4.5。 通过中速干滤纸过滤，弃去最初的5～10mL滤液，收集滤液于100mL锥形瓶中。 以下操作应避免直射光。 杂质氧化：于a、b、c三支15mL刻度试管中各吸入样液10mL（同时做平行），往试管a加入1mL核黄素标准工作液，往试管b、c各加入1mL蒸馏水。然后各加入冰乙酸1mL，旋摇混匀后逐个加入高锰酸钾溶液0.5mL，旋摇混匀，静置2min再逐个加入过氧化氢溶液0.5mL旋摇，使高锰酸钾颜色在10s内消退。加盖摇动试管，使试管中的气体逸尽。 测定：用荧光素溶液调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。 调激发波长445nm，发射波长530nm，测定试管a、b的荧光强度，样液在仪器中受激发光照射不超过10s。在试管c中加入20～30mg连二亚硫酸钠，摇动溶解，并使试管中的气体逸出，迅速测定其荧光强度作为空白。若溶液出现浑浊，不能读数。 6.结果的计算 6.1.计算公式 核黄素（μg／g，干基）＝ B－C × V × R A－B V1 m（1－H） 式中：A——试管a（样液加标样）的荧光强度； B——试管b（样液加水）的荧光强度； C——试管c（样液加连二亚硫酸钠）的荧光强度，空白； R——加入核黄素标样的量，μg； V——样液的初始体积，mL； V1——测定时取样液的体积，mL； m——样品质量，g； H——样品的水分百分率。 6.2.平行测定的结果用算术平均值表示，保留小数后二位，第三位按GB 1.1—81《标准化工作导则 编写标准的一般规定》中附录C数字修约规则取舍。 6.3.平行测定的相对差不得超过5％。 7.来源： GB 7629—87