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蛋白质分析 蛋白质的定量分析 构型或结构研究 蛋白质的氨基酸序列的测定 蛋白质的分类及结构 蛋白质的组成单位—氨基酸 多肽的结构 蛋白质的分类 蛋白质按生物学功能分类 蛋白质的一、二级结构 一级结构(primary structure): 肽链中氨基酸的序列以及二硫桥的位置。 二级结构(Secondary structure): 一条多肽链或链的一部分依靠氢键维持的局部有规则的构型称为二级结构。(肽链的主链在空间的排列) α－螺旋(α -Helix)、β－折叠(β -Pleated Sheet)、β－转角(β -Corner)等。二级结构还包括无规则卷曲（Random wind）以及非氢键维系的规则结构和侧链的构型等。 a 螺旋 β－折叠 两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集, 相邻肽链主链上的-NH和C=O之间形成有规则的氢键。 β－折叠分平行式(肽链的N末端都在同一方向)和反平行式(相邻肽链是反向的)。 蛋白质的三级结构 三级结构(tertiary structure): 肽链通过盘旋或折叠形成紧密的借各种次级键维持的球状结构。 　 极性特点: 疏水的内核，亲水的表面。 　 维持蛋白质三级结构的各种作用力： 疏水作用、氢键、范德华力、 离子键、二硫键及配位键。 蛋白质的四级结构 蛋白质亚基 分子量较大的蛋白质分子由多条肽链组成，这些具有球形三维结构的多肽链称为蛋白质亚基。 寡聚蛋白及多聚蛋白 蛋白质四级结构(Quaternary structure) 寡聚蛋白质中不同种类和数目的亚基在空间的排布及亚基之间的相互作用。 　 均一四级结构，非均一四级结构。 　 维持四级结构的作用力主要是疏水作用力。． 蛋白质构象 蛋白质构象 蛋白质的变性 天然蛋白质分子在外界因素的作用下，由紧密有序的结构变成松散无序的结构，并使蛋白质的物理化学性质及生物活性发生变化的现象。（变性一般只涉及次级键，二硫键的断裂，不涉及一级结构的变化） 蛋白质分析方法 紫外光谱法（２） 荧光光谱法 化学方法(1) 原理：所有的含氮化合物在浓硫酸和催化剂（通常为铜离子）的存在 下加热转化为氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵而稳定存在于溶液中。蛋白 质中氮的含量一般是16%。 　 　 评价：常用于动植物食品中蛋白质含量的测定。 　 其它含氮化合物被同时测定,方法较复杂、费时。 凯氏(kjeldahl)定氮法(2) 化学方法(2) 原理：在碱性硫酸铜溶液中，铜离子与四个分子的双缩脲中的亲核氮原子 配位，形成紫色络合物．蛋白质分析中，亲核基团由肽键提供。 最大吸收：330 nm, 545 nm Doumas配方：硫酸铜，酒石酸钾钠和氢氧化钠 评价：双缩脲法是较通用的测量蛋白质总量的方法。 优点：操作简单快速，适用于自动分析仪。 缺点：灵敏度低（约1mg/ml），测定范围1~10mg/ml。 双缩脲反应 双缩脲反应定量蛋白质示例 试剂 　 硫酸铜　1.5 gl-1 　 酒石酸钾钠　6.0 gl-1 　 氢氧化钠　30.0　gl-1 方法 　 0.5ml　蛋白质溶液 　 4.5ml　试剂 　混合反应30min 　 545nm　吸收测量 校准 　 用标准蛋白质0.5-20.0 g l-1做标准曲线 化学方法（３） 原理：Folin（磷钼酸盐－磷钨酸盐）试剂，检测酚基（蛋白质中的酪氨 酸残基）。Folin试剂(磷钼酸盐－磷钨酸盐)与铜离子结合时其灵敏度可 大大提高。低浓度的双缩脲试剂与蛋白质形成的Cu2+-蛋白质络合物可以 还原Folin试剂的主要成分磷钼酸盐－磷钨酸盐到钼蓝和钨蓝。 　 测量：７５０nm (600~800nm) 　 评价: 优点：灵敏度高(比双缩脲法高100倍)。 　 缺点：费事，干扰物质多，酪氨酸含量差异的影响大。 劳里法定量蛋白质示例 试剂 1.碱性铜试剂 20mg l-1硫酸铜，20mg l-1酒石酸钾钠， 20 g l-1碳酸钠，40 g l-1氢氧化钠