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生物素—亲合素系统生物素－亲合素系统(Biotin-Avidin—System,BAS)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统.随着各种生物素衍生物的问世,BAS很快被广泛应用于医学各领域.1979年Guesdon利用生物素和亲合素间具有高度亲合力的特点,建立了标记亲合素和生物素法(LAB／BA)与桥联亲合素—生物素技术(BRAB).1981年Hsu首次报告了改进的亲合素—生物素—过氧化酶复合物法(ABC法).近年大量研究证实,生物素—亲合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合,如酶、荧光素、同位素、凝集素、铁蛋白、SPA等.生物素—亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应,使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏.BAS已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术. 生物素又称维生素H,多从含量较高的卵黄(α型)及肝组织(β型)中提取,亦可人工合成.生物素分子量为244.31,分子式为 C10H16O3N2S,pI为3.5,是羧基转化酶作用的一种辅酶,故又称辅酶R,具有α、β两型,其生物活性基本相同.生物素环形结构中的I环为咪唑酮环(又称Ureido环)(I环),是与亲合素结合的主要部位；生物素的Ⅱ环结构为噻吩环,带有一个戊酸侧链,末端羧基是标记抗体和酶的唯一结构.抗体分子经生物素化后,其结合抗原的活性不受影响.多种酶结生物素化后,其催化力保持不变或稍有降低.因此生物素可与多种标记物结合,适用于多种免疫检测技术. 亲合素主要包括卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素等.后两种因其特异性亲合力低,研究不多,前两种目前已深入研究并得到广泛应用. 1、亲和素(Avidin；A) 亲合素又称卵白蛋白或抗生物素,分子量为68000,pI 10～10.5；在pH 9～13缓冲液中性质均稳定,耐热并耐多种蛋白水解酶的作用.天然亲合素为碱性蛋白,由4个相同的亚单位构成4聚体；每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与生物素中的Ureido环结合.因此,1个亲合素分子存在4个与生物素分子结合位点,其结合常数(Ka)高达1015mol/L. 通常,亲合素的活性单位是以亲合素结合生物素的量来表示的,即以能结合1Pg生物素所需要的亲合素量为1个亲合素活性单位.一般1Pg亲合素约含13～15个活性单位. 2、链霉亲合素(Streptavidin,SA) 链霉亲合素(SA)是与亲合素(A)有类似生物学特性的一种蛋白质.是由Streptomyces avidin菌在培养过程中分泌的一种蛋白质产物,SA也可通过基因工程手段生产.SA分子量为65000,由4条序列相同的肽链构成,每条SA肽链可以结合1个生物素分子.因此与A一样,每个SA分子也具有4个可与生物素分子结合位点,其结合常数与A相同为1015mol/L.约为抗原抗体间Ka (105～1011 mol/L)的1万倍以上. SA与A的ka虽然相同,但在实际应用中其检测灵敏度明显优于A,其原因是SA为略偏酸性的蛋白.SA的每条肽链含159个氨基酸残基,其中赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的含量比一般亲合素少,反之含酸性氨基酸较多,其等点为6.0,较A(pI＝10)为低,同时在结构中SA不含任何糖基,而A含糖可高达10％.A的高pI及高含糖结构导致在聚苯乙烯板和硝酸纤维素膜上或与组织细胞DNA结合时,易产生一定程度的非特异性结合,造成较高的显色背景,而SA较A在应用中明显克服了这一缺点. SA最高的活性可达18u,较A高(15u)；与A一样,每个SA分子也具有4个可与生物素分子结合位点,故其效应相同. 生物素-亲合素不仅可与多种标记物稳定结合,而且能偶联抗体等大分子物质,因此建立了许多检测方法,成为免疫学、分子生物学领域中广泛应用的新技术系统之一. 生物素-亲合素系统具有以下显著特点: 1、高度特异性生物素-亲合素系统的结合反应因其亲合力极高而呈现高度专一性,生物素、亲合素一旦结合则很难分离,这种高度特异、稳定地结合,使反应试剂可经得起高度稀释,因而可明显降低或避免了反应中可能存在的非特异性作用. 2、高度灵敏性亲合素可通过4个结合位点多价桥联生物素的反应物和标记物.另外,生物素化的大分子蛋白、核酸、酶等物质不仅保持其活性不受影响,更因生物素化形成许多触手的多价制剂,使整个反应体系出现多级放大效应,因而赋予BAS极高的灵敏性. 3、简易、快速、安全、稳定、BAS的高度特异性及灵敏性,使其在反应体系应用中用量极微,故成本低廉.反应程序于数小时即完成,结果易观察.生物素标记试剂可于4℃存放两年而效价不变. 4、应用广泛 BAS可与多种标记系统如酶、荧光素、铁蛋白、凝集素、SPA、放射性核素等联合用于抗原、抗体、蛋白、激素、受体、核酸系统等多种生物学反应体系,也可作为亲合介