乳酸乳球菌食品级表达载体—受体系统的构建及异源基因的表达研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 通过同源双交换，构建了染色体上的IacF基因内部有部分缺失的食品级受 体菌WZ103。含IacF基因的互补质粒pMG36eF能使WZ103的Lac+表型得到恢 复，表明pMG36eF上的IacF基因的表达能互补WZ103中IacF基因缺陷。酶切 去除pMG36eF上的红霉素抗性基因(erm)，构建了以IacF基因为唯一选择标记 的食品级载体PWZ101。在食品级载体pWZ102上，乳糖诱导启动子Pla“被用于 控制异N基因的表达。分别构建了人谷肤甘肤硫转移酶Al(hGSTAI)和人铜锌超 氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)的表达受启动子PracA控制的食品级表达载体pWZ103 和pWZ104。它们在WZ103中能分别表达的hGSTAI或Cu/ZnSOD，并且表达 的Cu/ZnSOD具有生物活性。以整合型载体pORI19(I)为辅助质粒时，共电转化 法也可用于食品级载体的构建。 新的葡激酶基因亚型 :akXH基因被克隆并在大肠杆菌中得到了高效诱导表 达，表达产物有特异的纤溶活性。表达质粒pAH和pPAH上，sakXH基因的表 达分别受单一启动子PracA或由双启动子Paz-PIacA的控制。电转化导入乳酸乳球菌 MG5267后，通过Western杂交及纤溶平板法检测并比较:akXH基因的表达水平， 结果表明，双启动子P32-P1a,A比单启动子PracA更强，并且与P32融合后PracA仍可 被乳糖诱导。因此，利用两个线性排列的双启动子能有效地提高了乳酸乳球菌表 达系统的表达水平。 克隆了霍乱毒素B亚单位基因((ctxB)并在大肠杆菌BL21DE3(pLysS)获得了 IPTG诱导的高效表达，且表达产物为包涵体形式。 关键词:乳酸乳球菌;食品级表达系统;人谷肤甘肤硫转移酶;人铜锌超氧化 物歧化酶;启动子;葡激酶;霍乱毒素B亚单位 孚L酸乳球菌食品级表达载体一受体系统的构建及异源基因的表达 Constructionoffood-gradeexpressionvector-hostsystemin Lactococcuslactisandtheexpressionofheterologousgenes WeiWenzhong(Genetics) DirectedbyDr.,Prof.TanHuarongandDr.XiangHua Food-gradehostLactococcuslactisWZ103whosechromosomalIacFgenehad partiallyin-framedeletionwasconstructedbyhomologousdoublecross-over.After theintroductionofcomplementaryplasmidpMG36eFwhichcarryingtheIacFgene, WZ103restoredLac+phenotype,indicatingthattheexpressionofIacFgenein pMG36eFcouldcomplementthelacFgenedeletionofWZ103.Afterremovingthe erythromycinresistancegene(erm)frompMG36eFbyrestrictionendonucelases, food-gradevectorpWZ101containingtheIacFgeneassoleselectivemarkerwas constructed.Furthermore food-gradeexpressionvectorpWZ102was constructedinwhichalactose-inducedpromoterPt_Awasusedfortheexpressionof heterologousgenes.Food-gradeexpressionvectorspWZ103andpWZ104,inwhich humanglutathioneS-transferaseAl(hGSTAI)andhumanCu/Znsuperoxide dismutase(Cu/ZnSOD)wereunderthecontrolofpromoterPla4,,wereelectr