乳酸氧化酶和透明颤菌血红蛋白融合表达的研讨.pdfVIP

乳酸氧化酶和透明颤菌血红蛋白融合表达的研究 1,2 2* 1 1 1,2 3 3 宋伟 ，罗晖 ，常雁红 ，周新勇 ，纪钦洪 ，于慧敏 ，沈忠耀 1 2 （北京科技大学环境工程系，北京 100083 ；北京科技大学生物科学与技术系，北京 100083 ； 3 清华大学化工系，北京 100084） 摘要 首先从绿色气球菌当中得到乳酸氧化酶（LOD ）的基因，再将LOD 的基因克隆到表达载体pET-28a(+)上，构建得到重组菌 BL21(DE3)/pET-LOD ；再采用Overlap PCR 的方法，对透明颤菌血红蛋白（VHb ）基因和LOD 基因进行融合，分别在LOD 的N 端 和C 端对VHb 进行融合，构建得到两株重组菌：E. coli BL21(DE3)/pET-HVb-LOD 与E. coli BL21(DE3)/pET-LOD-VHb ，并最终在 表达载体pET-28a(+)上表达得到融合蛋白VHb-LOD 与LOD-VHb ，从而在分子水平上提高重组菌催化过程中O2 的输送和利用效率。 实验结果通过SDS以及酶活分析，证实原始蛋白LOD 、融合蛋白VHb-LOD 与LOD-VHb 均得到得到良好表达。研究发现， 融合蛋白VHb-LOD 的表达可以促进重组菌的生长，提高了重组菌BL21(DE3)/pET-VHb-LOD 催化乳酸的能力，最终有利于丙酮酸 的积累，说明VHb 的融合蛋白策略确实可以提高需氧酶LOD 的催化效率；但融合蛋白LOD-VHb 则未表现出LOD 的催化活性，推 测可能是在融合蛋白中，VHb 在空间上阻碍了LOD 活性中心与乳酸的接触，从而影响了催化反应的进行。 关键词 透明颤菌血红蛋白；乳酸氧化酶；融合蛋白；Overlap-PCR 1 引言 通过生物酶法转化乳酸生产丙酮酸是一种绿色环保的生产方式。常规的酶转化法生产丙酮酸是采用乳 + + + + 酸脱氢酶来催化乳酸，但此酶需要NAD /NADP 作电子受体，NAD /NADP 价格昂贵，且不易重复使用， [1,2 ] 使乳酸脱氢酶不能广泛和大规模使用 。 而乳酸氧化酶作为一种黄素蛋白，是以FMN 或FAD 作为辅因子，其电子转移的形式不同于经典的 电子传递链，而是直接以氧作底物，FMN 或 FAD 和酶蛋白结合非常牢固，整个反应过程不需要游离的 外源辅酶参与，这就彻底解决了辅酶再生的问题，从而成为制备丙酮酸的理想的酶[3] 。细菌乳酸氧化酶 催化的生化反应式为： CH CHOHCOOH + O CH3COCOOH + H O （） 3 2 2 2 1 在酶催化过程中O2 的传输效率往往是制约需氧酶催化效率的重要因素，因此从提高需氧酶催化效率 的角度考虑，有必要建立一种有效的氧气输送机制。 透明颤菌( Vitreoscilla)是一种革兰氏阴性专性好氧菌，它在微氧条件下能够合成一种类似于血红蛋白 的胞内可溶物质——透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin, VHb)[4] 。VHb 能够从分子水平上提高重组 [5~6] 菌对氧气的利用率、促进菌体生长、提高需氧酶催化效率，从而提高发酵过程中的产物的产量和收率 。 [7~8] 到目前为止，VHb 已经在α-淀粉酶、青霉素酰化酶和PHB