分析我院消化科幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药与gyrA基因突变关系.docVIP

精品论文 参考文献 分析我院消化科幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药与gyrA基因突变关系 洪鉴光 　　【摘 要】 目的 分析幽门螺杆菌(Hp)对左氧氟沙星耐药性及左氧氟沙星耐药菌株与敏感菌株间gyrA基因的DNA序列差异，探索gyrA基因突变在Hp左氧氟沙星耐药产生过程中的作用。方法 我院消化科2011年2月至2013年2月进行胃镜检查的慢性胃炎、消化性溃疡的患者，将胃镜活黏膜标本接种于Hp选择性培养基，37℃微需氧环境培养3-5d，分离Hp菌株，采用氧化酶试验、过氧化氢酶试验、尿素酶试验和UreA基因PCR扩增鉴定菌种。左氧氟沙星药敏试验采用E-test法，筛选出耐药菌株和敏感菌株。提取Hp菌株基因组DNA，PCR扩增gyrA基因并进行测序并分析。结果 38例临床分离Hp菌株通过左氧氟沙星E-test药敏试验，其中12例最低抑菌浓度（MIC）＞1.0ug/ml，耐药菌株占31.58%，敏感菌株占68.42%。gyrA基因测序结果显示，261、271和272位点在10例耐药菌株存在突变；C261A突变2例，C261G突变1例，G271A突变2例，A272G突变2例，C261A与G271T、A272G突变2例，G271A与A272G突变1例，而在26株敏感菌株未发现突变。结论 我院消化科分离Hp的临床菌株左氧氟沙星耐药率较高，其耐药与gyrA基因261、271和272位点有关。 　　【关键词】 幽门螺杆菌； 左氧氟沙星； 敏感菌株间gyrA基因； DNA序列差异 　　幽门螺杆菌(Helicobacter pyroli，Hp)感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤等多种消化系统疾病具有密切的关系，已被世界卫生组织列入I类致癌原[1]。而Hp的耐药性是导致Hp根除失败的重要原因，所以Hp感染的治疗是Hp研究领域中的核心问题。目前常用的抗生素如甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素都存在不同程度的耐药问题，耐药率有不断增加趋势[2]。近年来国内外Hp共识意见新推荐左氧氟沙星作为Hp根除药物，左氧氟沙星是一种新型的氟喹喏酮类抗生素，抗菌谱广、疗效高、不良反应少[3-4]。本研究采用E—test方法分析Hp在我院消化科收治病人的左氧氟沙星耐药特征，并测序分析了gyrA基因突变与左氧氟沙星耐药的关系。 　　材料与方法 　　1．实验菌株：38株Hp分离菌株来自我院消化科2011年2月至2013年2月进行胃镜检查的???性胃炎、消化性溃疡的患者，检查前1个月内未服用抗Hp药物。 　　2．细菌培养：采用匀浆接种法接种。用高压灭菌过的滴管吸取标本及其转送液至1 ml匀将器中，轻轻研磨8～10次后，用灭菌滴管，吸取组织混匀液，置于分离培养基上，用接种环作分段分离，置于35℃，在5％O2、10％CO2、和85％N2的三气培养箱中培养72 h。 　　3．Hp菌种鉴定：挑取可疑菌落，涂片染色镜检呈革兰染色阴性，菌体细长弯曲呈螺形、S形或海鸥形，氧化酶试验阳性，过氧化氢酶试验阳性，尿素酶试验阳性。采用PCR扩增Hp的UreA基因，上游引物为5_GCCAATGGTAAATTAGTTCC 3，下游引物为5-CTCCTTAATTGTTTTTACAT一3；反应体系为10times;PCR反应缓冲液5.0ul，25um dNTP 1.0ul，10um引物各1．0ul，Taq DNA聚合酶(大连宝生物技术有限公司)1．O U，模板DNA(100 ng／uL)1．Oul，加无菌去离子水至50ul。反应条件为94℃5 min；94℃ 30 s，52℃，45 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃延伸5 min，1％琼脂糖凝胶电泳30 min后，观察结果。 　　4．左氧氟沙星药敏试验：将Hp菌株用灭菌0．9％氯化钠溶液制成3个麦氏单位的菌悬液。使用棉签浸入菌悬液.分三个方向涂抹平皿表面。凉干10～15 min，放置E—test纸条。微需氧三气培养箱中培养3～5 d后观察结果。判断标准根据文献[5—8]，最低抑菌浓度(MIc)ge;1．0ug/ml为耐药。 　　5．PCR扩增Hp的gyrA基因：根据J99标准菌株的基因组序列(AE001439)采用Primer 5．0 　　设计引物扩增gyrA基因，引物为gyrA—F：5rsquo;一TTTCTTTCAATCTTACAAA ATAAGC一3rsquo;，gyrA R：3- ATCACCTTGTTTAGTCGCTA一5rsquo;，产物长度为1273 bp。反应体系为10times;PCR反应缓冲液5．Oul，25um dNTP 1．0ul，10um引物各1．0ul，Taq DNA聚合酶(大连宝生物技术有限公司)1．0 U，模板DNA(100ng/ul)1．0 ul，加无菌去离子