和厚朴酚对念珠菌的体外抗菌活性及机制初探.docVIP

精品论文 参考文献 和厚朴酚对念珠菌的体外抗菌活性及机制初探 张莉敏1 张传涛2 （四川成都中医药大学附属医院 610073） 【摘要】目的 了解和厚朴酚（Honokiol,HNK）对白念珠菌的体外抗菌活性；初步探讨其作用机制。方法　临床分离的念珠菌24株，前期药敏实验证实对氟康唑耐药，采用微量稀释法微量稀释法（NCCLS-M27A）检测HNK体外抗菌活性；并以白念珠菌耐药标准菌株ATCC64550为研究对象，设为空白组、实验组，实验组给予 50mu;g/ml浓度的HNK，共培养24小时后在透射电镜下观察念珠菌细胞形态结构变化。结果　HNK体外对氟康唑耐药念珠菌有抑菌作用，其MIC（minimal inhibitory concentration) 范围为12.5～100mu;g/ml。HNK作用后真菌细胞变形，部分细胞膜不完整，内容物外露，近细胞壁处有较大面积低电子密度区，细胞质内有小空泡产生。结论　HNK对念珠菌体外具抑菌作用，可能是通过作用于细胞壁而实现。 【关键词】 和厚朴酚 念珠菌 微量稀释法 机制 【中图分类号】R285 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）19-0134-02 念珠菌引起的真菌感染的发生率及病死率正持续上升[1]，临床常用抗真菌药物治疗周期长、价高、抗菌谱窄、药物毒性大、三唑类药物耐药以及患者耐受性差等问题[2]。HNK是中药材厚朴中提取的有效单体活性成份，因发现其有抗肿瘤作用[3-5]而成为近年来的研究热点，研究认为其有一定抗细菌作用。但有对抗真菌作用研究不多。我们试图采用国际公认的NCCLS-M27方案来研究HNK体外对耐药念珠菌敏感活性，并探索其可能的作用机制。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验菌株和质控菌株：均来自四川大学华西医院实验医学科微生物室；24株实验白念珠菌来源于临床送检标本，标准质控菌株为白念珠菌耐药株ATCC64550；经形态学及念珠菌显色培养基鉴定到种，前期药敏试验证实对氟康唑耐药。分离纯化的菌种用制备好的甘油肉汤保存于-20℃冰箱，试验前将菌株在沙保罗弱培养基上划板接种，35℃孵箱培养24h。 1.1.2 实验药品、试剂及设备：HNK化学对照品（纯度100%，四川省药检所）；96孔细胞培养板（Cosmo）；超净台（中国苏清AiR TECH; VS-1300型）；日立H-600IV型透射电镜等。 1.2 方法 1.2.1 HNK对24株临床分株念珠菌的体外药敏试验 采用NCCL S推荐的微量液体稀释法[6]。将制备好的抗真菌药物母液用RPMI1640液体培养基做稀释液进行倍比稀释。HNK的各级浓度分别为800～3.1mu;g/ml.接种后终浓度分别为400～1.55mu;g/ml，同时保证DMSO的最终接种浓度低于1%。将各级倍比稀释后的抗真菌药物液加入96孔细胞培养板中，从每排第1至第10孔分别加入经过倍比稀释的浓度依次降低的药液各100mu;l。第11孔加入RPMI1640液100mu;l，作为阳性生长对照孔，第12孔为阴性对照孔，加入RPMI1640培养液200mu;l。每次配制药敏板的同时均制备一块质控药敏板，微量稀释药敏板保存于－70℃冰箱。经两次35℃培养24h的试验念珠菌株，取5个直径大于1mm的菌落用0.85%的无菌盐水制成菌悬液，震荡15秒，并用分光光度计调整其浊度，酵母菌浊度均为0.5麦氏标准浊度（相当于1times;106～5times;106CFU/ml），以RPMI1640液体培养基稀释1000倍至最终浓度为1～5times;103CFU/ml（作用浓度为0.5～1times;103CFU/ml）。将冷冻的药敏板按在4℃、室温下各放置1h的程序融化，然后置于超净工作台上，用移液器分别加100mu;l配制好的菌悬液于每排第1至11孔中。将接种好菌液的药敏板置于温盒内，然后置于35℃孵箱内静置培养24小时。 1.2.1.1 最低抑菌浓度的判定 每孔的生长情况与阳性对照孔作比较并按以下尺度评分： 0：完全透明; 1：雾状混浊；2. 浊度明显降低(与生长对照孔相比超过80%生长抑制)；3. 浊度轻度下降；4. 浊度未降低。与生长对照孔相比超过80%生长抑制所对应的最低药物浓度为HNK药物的MIC值。 1.2.1.2设置对照 每次试验均设置对照，对白色念珠菌敏感株ATCC64548和耐药菌株ATCC64550分次进行反复测定，只有当其M