利用蛋白水解液进行藻青素生物聚合物的微生物合成.docVIP

Rendered-protein hydrolysates for microbial synthesis of cyanophycin biopolymer 利用蛋白水解液进行藻青素生物聚合物的微生物合成 藻青素是一类由细菌胞内产生和储存的多聚（精氨酰-天冬氨酸）生物聚合物。藻青素已被提议作为一种可再生替代石化工业产品。一种丰富的氨基酸和氮如蛋白水解物。蛋白主要是用来在动物和水产作为饲料添加剂。新用途扩大这一类蛋白质市场规模。我们准备和肉骨粉水解，接着首次证实，这些水解可用于发酵生产藻青素。利用备肉类和骨粉酶水解，我们获得藻青素产品在摇瓶和10生物反应器发酵研究采用酪氨基酸33%–35%。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示的分子量24kDa。结果利用蛋白副产生产生物聚合物一个新的途径。 藻青素作为一种代替石化工业产品的生物可降解物最近已引起科学领域的关注。针对CGP应用的最大市场是大量的水处理行业，CGP的多聚（天冬氨酸）主链聚合物能够作为一种环保物取代作为常用软水剂的聚丙烯（丙烯酸）。 CGP及其相关的聚天冬氨酸主链其他潜在的应用是作为金属离子交换系统[ 10 ]，作为水凝胶材料[ 11 ]，并作为生物技术的通用资源和重要化学品[ 12 ]和[ 13 ]保健品平台。从事与藻青素及其衍生物生产和生物降解相关的技术和经济问题研究的研究事业很多[ 1,14,15 ]。 CGP（事实上大多数的生物技术生产的工业产品）成功商业化生产的一个很大挑战是符合原料成本效益的管理或利用[ 16–18 ]。从这方面考虑，低成本的剩余农产品原材料和副产品，是发展可行性发酵原料或基质的理想物质。针对CGP的微生物生产，有研究表明除了通常的碳源和氮源，提供一个氨基酸源对于实现产品的高产是至关重要的[19–21 ]。名为蛋白胨的产品，是一种为了增加氨基酸为目的的培养基添加剂。商用蛋白胨价格昂贵，增加总体原料成本[ 22 ]。因此一类氨基酸含量较高的农工副产物对生物技术生产CGP是有利的。马铃薯加工厂（贸易名字：portamylasse）的副产物流含有大量的精氨酸，天门冬氨酸，和天冬酰胺，它被证明能支持CGP合成[ 17,23 ]。在本文中，我们描述了利用水解（肉骨粉）作为氨基酸来源，通过含有克隆藻青素合成酶基因的重组大肠杆菌来生产CGP[ 19 ]。肉骨粉是一个从滞销动物组织中提炼出来的产物，如屠宰场副产品和滞存货24 ]。如果在处理过程中的任何组织来自反刍动物动物，由此产生的产品被称为“反刍动物肉骨粉”且其使用受特殊限制，根据不同的国家而不同[ 25 , 26 ]。例如，在欧洲，反刍动物肉骨粉目前不能被用于喂养任何可能本身成为人类的食物的动物。鉴于这些限制，探寻反刍动物肉骨粉的新的出路是必须的[ 27 ]。在本研究中，我们展示了成功地利用肉骨粉水解液对藻青素的生产。 材料与方法 细菌和培养条件 构建基因工程大肠杆菌DH1，含有重组质粒：pMa/c5-914::cphA，如先前所介绍 [19 ]。克隆藻青素合成酶基因的质粒来自于Synechocystis sp. PCC6803。LB培养基（1%w/v 胰蛋白胨，0.5%w/v酵母提取物和0.5%氯化钠）被用于大肠杆菌的常规培养和维持。羧苄青霉素（50 μg/mL）用于维持培养基中的选择性压力。细胞在37℃ 250rpm的旋转振动器中生长。酪蛋白氨基酸（CA）来自于MP Biomedicals (Solon, OH)。 蛋白胨和蛋白胨原材料 实验蛋白胨来自于反刍动物肉骨粉，这主要从Darling International 获得（欧文，德克萨斯州）。（在本文中，我们将术语肉骨粉水解产物和蛋白胨互换，因为后者是一个对各种蛋白质水解物常用的商业术语。）蛋白胨的详细生产过程在一个单独的文章论述[ 28 ]。简单地说，水解作用前，肉骨粉被己烷脱脂萃取。水解作用是在一个带有恒定搅拌装置的恒温反应器中进行的，以保持肉骨粉处于悬浮状态。所有的反应液中包括9.1%（w/w）的肉骨粉。配制碱性水解液（MA16）6L，0.1g Ca(OH)2/g为基质，在85℃，放置16小时。通入二氧化碳至PH值下降到9，反应终止，其次是用硫酸中和。50℃配制4L酶水解液（M ALC FLA)）。反应开始时碱性蛋白酶2.4 L（诺维信集团，巴格斯瓦德，丹麦）加到0.4AU/g基质中；连续监测pH并通过添加8M的NaOH来维持pH值在8.5。四小时后，pH值允许下降到7，加入风味蛋白酶（诺维信集团）在50 LAPU/g基质中。八个小时后，通过提高反应温度到90℃保持10min使反应终止。 任何一种类型的反应后，剩余固体物质被通过离心分离，接着用孔径0.45μm的过滤容器过滤。剩余的水解液使用Bu¨ch B-191（弗拉维尔，瑞士） 微型