丁酸梭菌C2菌株对鱼类肠道致病菌体外抑制作用研究.docVIP

丁酸梭菌C2菌株对鱼类肠道致病菌体外抑制作用研究 ? 100?(总第151期)水利渔业2007年第27卷第3期 丁酸梭茵C2菌株对鱼类肠道致病菌体外抑制作用研究 宋增福r,吴天星,宋会仪 (浙江大学化学系,杭州3100272上海水产大学生命学院200090;浙江大学动物学院,杭州310029) 摘要:以枯草芽孢杆菌,硫酸链霉素为对照组,以丁酸梭菌c菌株为试验组,运用滤纸片琼脂平板扩散 法,研究了丁酸梭菌c菌株对鱼类肠道致病菌迟缓爱德华氏菌,鳗弧菌,嗜水气单胞菌的抑制作用.研究结 果表明,丁酸梭菌c菌株可以有效抑制这3种病原菌,并且抑制效果要明显优于硫酸链霉素. 关键词:丁酸梭菌;抑菌作用;鱼类肠道致病菌 中图分类号:$942.3文献标识码:A文章编号:1003—1278(2007)03—0100—02 随着我国水产养殖业的快速发展,水产病害已经成 为限制水产业进一步发展的瓶颈因素,而长期使用抗生 素和化学药物防治水产病害,会增加药残和病原的耐药 性,直接危及到人类健康和生存环境.因此,控制水产养 殖疾病就迫切需要高效无污染,无毒副作用的替代药品, 减少甚至禁止使用抗生素.现代微生态学研究表明,益 生菌(Probiotics)是一种能够改善宿主肠道菌群平衡并对 其有益的微生物,饲料中添加益生菌不仅能避免抗生素 的副作用,达到防病治病的效果,而且能促进动物生长. 因此,在现代生产条件下,水产益生菌的研究和开发受到 重视,益生菌应用技术获得了前所未有的发展机会. 丁酸梭菌自从被日本研究人员发现以来,一直作为 防治肠炎的药物在临床上得到应用,尤其是在日本,韩国 等东南亚国家.丁酸梭菌可以形成芽孢,具有耐高温,耐 酸,耐盐和耐挤压等特性,在制粒过程和酸性的动物肠道 环境中均能保持高度的稳定性.试验研究还表明,丁酸 梭菌可以有效地抑制出血性大肠杆菌,痢疾志贺氏菌,霍 乱沙门氏菌,霍乱弧菌等人和动物肠道里的有害菌群…, 其抑制作用被认为是起到治疗效果的主要原因之一.但 是该菌对引起鱼肠道疾病的有关致病菌是否有抑制作 用,至今没有见到相关报道.本研究目的是探讨丁酸梭 菌C,菌株对鱼肠道致病菌迟缓爱德华氏菌,鳗弧菌,嗜 水气单胞菌的抑制作用,为该菌作为水产类新兽药的研 制和开发提供基本数据. 1材料和方法 1.1实验设计 实验设丁酸梭菌C为试验组,枯草芽孢杆菌和硫酸 链霉素为对照组;每组分迟缓爱德华氏菌,鳗弧菌,嗜水 气单胞菌3个处理,每个处理3个重复.在12,18,24,36, 48h测定各实验组抑菌圈直径. 1.2材料 收稿日期:20o6—12—11 基金项目:浙江省重大科技攻关课题(2004201) 通讯作者:吴天星,E—mail:wutx@ 作者简介:宋增福,1971年生,男,山东蒙阴人,博士,主要从 事动物微生态与水产病害防治研究. 1.2.1菌种丁酸梭菌C,菌株由浙江大学宁波理工学 院分子设计与营养工程实验室保存;迟缓爱德华氏菌,鳗 弧菌,嗜水气单胞菌由上海水产大学农业部渔业动植物 病源库提供;枯草芽孢杆菌由无锡阿尔保尔生物工程有 限公司提供. 1.2.2培养基丁酸梭菌培养基:葡萄糖lg,胰蛋白胨 1g,酵母粉0.5g,牛肉浸膏0.3g,硫酸铵0.1g,硫酸锰 0.02g,硫酸镁0.05g,碳酸钙0.1g,氯化钠0.2g,磷酸氢 二钾0.4g,水100g,琼脂2g.致病菌与枯草芽孢杆菌的 培养基为牛肉膏蛋白胨营养培养基,调节pH值为6.9～ 7.6. 1.2.3主要仪器和设备医用超净工作台,电热恒温培 养箱,自动pH测定仪,电子天平,电热高压灭菌锅,显微 镜,冰箱,培养皿,吸管,试管,烧杯,三角瓶,量简,酒精 灯,滤纸片,二氧化碳厌氧工作站等. 1.3方法 1.3.1丁酸梭菌的活化丁酸梭菌的冻干粉接种于装 有液体培养基的小三角瓶,装量90mL,耐热薄膜塑料封 口,28~C静止厌氧培养24h,然后转接小三角瓶,接种量 为10%. 1.3.2致病菌和芽孢杆菌的活化嗜水气单胞菌,鳗弧 菌,迟缓爱德华氏菌和芽孢杆菌接种到装有牛肉膏蛋白 胨液体培养基的小三角瓶,装量90mL,耐热薄膜塑料封 口,电热恒温箱28~C培养24h,然后转接小三角瓶,接种量 为10%. 1.3.3丁酸梭菌的抑菌作用参考吴惠仙采用滤纸 片琼脂平板扩散法进行,稍作修改.将丁酸梭菌,枯草芽 孢杆菌活化后,初始接种密度为1.0×10/mL,24h后稀 释各菌液至1.0×10/mL.同时,活化摇床培养嗜水气单 胞菌,鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌,16h后接种已活化的密 度为1.0×10/mL的各致病菌株0.1mL到各平皿涂布, 并置入含有丁酸梭菌,枯草芽孢杆菌培养物及硫酸链霉 素(1000IU/mL)的药敏试纸进行拮抗实验.测定前,首 先将直径7.2mm的无菌滤纸片浸没于丁酸梭菌,枯