单克隆抗体技术相关总结.doc

单克隆抗体技术相关总结 一、前言 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 虽然单抗技术已经非常成熟，但是由于其经济价值，仍然有很多人在从事这项研究，而且其中也会遇到很多这样那样大问题。我本人就是其中一个，由于是第一次做单抗，所以过程中遇到了很多困难，终于在前几天得到了几株阳性克隆。 鉴于此，我将单克隆抗体制备的整个过程贴出来，同时搜索了丁香园里面一些战友的求助帖以及一些经典的应助帖，希望能对将要或是正在从事这项研究的战友们有些帮助。 ?二、动物的免疫选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。1.　颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　????????????????????初次免疫　　　　　　　1×10７/0.5ml ip （腹腔内注射）　　　　　　　　　　　　↓　2～3周后　　　　　　　　　　第二次免疫　　　　　　1×10７/0.5ml ip　　　　　　　　　　　　↓　3周后　　　　　　　　　　加强免疫（融合前三天）1×10７/0.5ml ip或iv（静脉内注射）　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　　取脾融合2.　可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。　　　　　　初次免疫　 Ag　1～50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射　　　　　　　　│　　　　　（一般0.8～1ml　0.2ml/点）　　　　　　　　↓3周后　　　　　　第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip　　　　　　　　│　　　　　　　（ip剂量不宜超过0.5ml）　　　　　　　　↓3周后　　　　　　　第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip　　　　　　　　│ （5～7天后采血测其效价，检测免疫效果）　　　　　　　　↓2～3周后　　　　　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv　　　　　　　　↓3天后　　　　　　　取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。论坛资源：免疫小鼠的选择！ （求助）单抗加强免疫到融合最多几天？单抗小鼠尾静脉免疫（求助）单抗babl/c小鼠的免疫方案（请教）用质粒免疫制备单抗单抗制备最后一次加强免疫方法（求助）如何用包涵体免疫小鼠制备单抗（求助）免疫原性很弱的抗原的单抗请教做单抗时小鼠免疫的时间间隔（求助）有关制备单抗时小鼠的免疫（求助）单抗制备的免疫方法（请教）免疫小鼠的选择！雌雄？ （请教）免疫小鼠雌雄的选择 （求助）免疫的鼠意外怀孕了，还能继续免疫吗？（交流）首次采用脾内免疫，第二次加强用完全佐剂还是用不完全佐剂好呢？（求助）免疫动物的实验操作指导（求助）免疫方案（求助）小鼠免疫方案的几个问题（求教）制备单抗的蛋白用量问题（求救）脂多糖免疫小鼠的方案（求助）小鼠免疫方法 （求购）单克隆抗体制备中的动物免疫（求助）单抗加强免疫到融合最多几天？ 三、骨髓瘤细胞的选取骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度，最好106个细胞/ml；④生长速度快，繁殖时间短。目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：