六微生物显微镜的直接计数法与微生物大小测定.ppt

实验六 微生物显微镜的直接计数法与微生物大小测定 一、目的要求 ? ????1.掌握使用血球计数器进行微生物计数的方法。 ????2.学习掌握测量微生物大小的基本方法。 二、基本原理 ?1.微生物数量的测定 ???? 记数室边长为1毫米，则其面积为1平方毫米。盖上盖玻片后，载片与盖玻片之间高度为0.1毫米，所以每个记数室体积为0.1立方毫米。 在计数时，通常以五个中方格的总菌数（每个中方格中数四个小方格）即20个小方格的总菌数（求平均值）。 例如：设20个小方格中的总菌数为A，悬液稀释度B，那么大格（0.1立方毫米的总菌数） A/20×400×B。 ?????????? 2.微生物大小的测定 三、器材? ????显微镜；血球计数板；手揿计数器；盖玻片；目镜测微尺；镜台测微尺。 ????酵母菌菌悬液； 四、操作步骤? 1.酵母菌细胞总数的测定 (1)先将计数板盖上盖片在显微镜下，从低倍找到计数器的位置，然后取出计数板。 (2)将稀释好的菌悬液摇匀，取一环由盖玻片边缘自行渗入。如一环不够可再取一环，使室充满。（不宜过多，也不可有气泡）放在镜台上。 (3)静止3-5分钟，先在低倍镜观察找到位置，然后换成高倍镜进行计数。样品不宜太浓或太稀，最好每小格控制在5-10个菌体为宜，计数需要重复二次。取平均值。先后二次误差太大，需再重复计数。 (4)清洗：计数板使用完毕后，再水中冲洗（切勿用硬物洗刷），洗后，自行凉干或吹干。 ?2.目镜测微尺的校正 首先把接目镜上的透镜旋下，然后将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入接目镜的隔板上，然后把镜台测微尺置于载物台上，使刻度朝上并对准聚光器。先用低倍镜观察，对准焦距，当看清镜台测微尺后，转动接目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使目镜测微尺Ｏ点与镜台测微尺的一条刻线重合，然后于另一端找重合线，计算两端重合线之间目镜测微尺和镜台测微尺各载若干格。因为镜台测微尺的刻度是在载物台上，所以每格的长度(10微米)就是实际测量时的长度。 用同法校正在高倍镜下目镜测微尺每格所量的载物台上物体的实际长度。 ?由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的接物镜，接目镜，镜筒长度等）进行，而且只能在这特定的情况下重复使用。 ?3.菌体大小的测定 目镜测微尺校正好以后，移去镜台测微尺以目镜测微尺来测量微生物占有几格（长、宽），测出的格数（估计小数点后面一位）乘上目镜测微尺每格长度，即该微生物的大小。 一般测量菌的大小在同一涂片上测10-20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。 测量酵母菌的长和宽。 五、实验结果? 1、P48题1 2、P55题1 六、思考题 1、根据你的体会，用血球计数板的误差主要来自那些方面？应如何避免误差，力求准确？ 2、当接目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变接物镜，目镜测微尺每格所量的镜台上物体的实际长度是否相同？为什么？ * * * * * ?1.微生物数量的测定 ????利用血球计数器在显微镜下直接计数，这是一种常用的微生物计数方法。此法是将菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数器载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于载玻片上的计数室上盖玻片后的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生物总数目。 ????血球计数器，通常是一块特制的载玻片，载玻片上有四条槽而构成三个平台。中间平台宽，其中间又被一短横槽而隔成两半，每个半边上面各刻有一个方格网。每个方格网共九大格，其中间的一大格（又称计数室）常用作微生物的计数，其构造如图。 ????计数室的刻度一般有两种：一种是大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格。另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格中都由16×25=400个小方格组成。 ????每一个大方格边长为1毫米，则其面积为1平方毫米。盖上盖玻片后，载片与盖玻片之间高度为0.1毫米，所以每个大方格体积为0.1立方毫米。 ????在计数时，通常以五个中方格的总菌数（每个中方格中数四个小方格）即20个小方格的总菌数（求平均值）。????例如：设20个小方格中的总菌数为A，悬液稀释度B，那么大格（0.1立方毫米的总菌数）A/20×400×B。 ????1毫升=1立方厘米=1000立方毫米 ??????