PicoGreen荧光法定量生物制品DNA残留在Modulus多功能检测仪上的应用.pdf

PicoGreen 荧光法定量生物制品 DNA 残留在 Modulus 多功能检测 仪上的应用 1．应用说明 疫苗是现代疾病预防中常用的控制方式。如今许多疫苗是细胞培养疫苗，比如重组乙肝 疫苗、狂犬病疫苗等大多数疫苗都采用细胞培养的方法生产。其中，疫苗的纯化是关键问题， 我们需要尽可能的去除宿主细胞 DNA 和宿主蛋白。假若宿主细胞的 DNA 和蛋白同疫苗一 起注入人体将会产生不可预料的后果。 常规的 DNA 含量的检测方法是在 260nm （A260 ）处测其吸光值。这种方法的主要缺点 是核苷酸、单链核酸和蛋白质对信号的影响很大，并且还会受到核酸制备过程中污染物的干 扰，无法区分 DNA 和 RNA ，而且这种方法不灵敏（ 5μg/mLdsDNA 溶液 A260=0.1 ）。 在 2010 年版《中国药典》的征求意见稿中，针对生物制品的 DNA 残留检测，药典提供 了两种检测方法。其中的PicoGreen 定量检测方法简单、方便，被多家生物制品厂所选择， 成为生物制品残留 DNA 检测的标准。 ModulusTM 单管型多功能检测仪是 Turner Biosystems 公司的一款产品，具有发光、荧光 和吸收光检测功能。使用 ModulusTM 单管型多功能检测仪，可以通过 PicoGreen 来精确定量 dsDNA 。如果使用微量适配器，可以将检测体积减少到 100ul 以下，节约样品的同时也节约 了染料的成本。 2 ．所需器材 TM Modulus 单管型多功能检测仪（9200-003 ） 微量适配器（9200-928 ） 微量比色皿 PicoGreen 试剂 3 ．试验方案 3.1 试剂准备 PicoGreen 是以 1mL 的浓缩液形式保存在无水的 DMSO （二甲基亚砜）中。实验当天， 配制 2 × PicoGreen 试剂的工作溶液，用 1 ×TE 按 1:200 的比例稀释浓缩液（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA ，pH7.5 ）。如果要准备足够的工作溶液测定 20 个样品，可在 20mL1x TE 中加入 100μL PicoGreen dsDNA 定量试剂。由于试剂容易吸附到玻璃表面，要在塑料容 器中配制。 PicoGreen 试剂见光易降解，所以应将配好的溶液用箔包住或放置暗处避光保存。 溶液最好在配制好数小时内使用，以保证最佳结果。 3.2 DNA 标准曲线 北京原平皓生物技术有限公司 电话：010803 传真：010 E-mail ： order@ Web ： 3.2.1 标准品工作液的配制：Sigama 小牛胸腺嘧啶 DNA 干粉（货号：D4522-1MG ）1mg （Tris， Nacl 等浓度已成标准体系），加入 1mL 双蒸水，配制成 1mg ∕mL 的标准品工作液； 3.2.2 标准品工作液稀释： （1）母液稀释：取 10ul （1mg ∕mL ）标准品工作液加入到990ul TE 溶液中，浓度稀释成 10ug ∕mL ，取 10ul （10ug ∕mL ）标准品工作液加入到990ul TE 溶液中，浓度稀释成 100ng ∕mL ； （2 ）倍比稀释：取 800ul （100ng ∕mL ）的标准品工作液加入到200ul TE 溶液中，浓度达 到 80ng ∕mL （药典规定：荧光染色方法DNA 含量在 1.25-80 ng/mL 范围线性较好, 该 法 DNA 检出限为 0.3 ng/ml ），取 500ul （80ng ∕mL ）的标准品工作液加入到500ul TE 溶液中，浓度稀释到 40ng ∕mL ；依次倍比稀释，配成20ng/ml 、10ng/ml、5.0ng/ml、 2.5ng/ml 、1.25ng/ml、0.625ng/ml 的标准品溶液； 3.2.3 标准曲线的制备：倍比稀释后的各梯度标准品溶液和染料工作液各取 100ul 混匀，避光 室温放置 5min 。 2×DNA 溶液浓度 2×DNA溶液的体积 2 ×PicoGreen 溶液的 PicoGreen 试剂测定