百日咳杆菌丝状血凝素的纯制及其生物学特性的研究.docVIP

百日咳杆菌丝状血凝素的纯制及其生物学特性的研究 百日咳杆菌丝状血凝素的纯制及 其生物学特性的研究 垄查董晓明何长民 蛐划72..) 度景军囊譬舻 关键丝状血凝素层斩亘堕堑堕 前言 嘁精 百日咳杆菌丝状血凝素(Filamentous Hemagglutinin;FHA)是百日咳I相菌株分泌 的一种血凝素”,它是一种直径2nm,长约4O i00nm丝状结构的蛋白质.分子量133.000 d,具有高度的血凝活性,对术瓜蛋白酶敏 感”,它在百Et咳杆苗对呼吸遭上皮细胞的粘 附中起作用,是百Et咳杆菌保护性抗原之 . 【5—7] 有关FHA纯化的资料报遭较多.Arai 等”采用琼脂糖凝胶层析法分离;Morse用不 连续氯化铯梯度离心及葡聚糖凝胶G一150柱 层析进行分离;Irons等采用亲合层析的方法 分离.他们分离的FHA均有少量PT(Pertus sisToxin;PT)的污染.8o年代,Sato等”采用 多步骤层析法可获得毫克级FHA,但同样存在 纯度不甚高的缺陷.综上所述的纯制方法,都存 在步骤繁复,纯度不高,污染有少量PT,且收 量较低等问题.为此本文采用两种不同方法.由 百日咳杆菌培养液中分离纯制FHA组分.以 期选择出产量高,纯度好的纯制方法.为无细胞 百日咳菌苗质检提供FHA参考品. 1材料和方法 1.1菌种及细菌培养 接种百日咳CS菌株于B—G培养基上.37培 养72小时.于Stainer—Scholte(Ss)液体培养基中静 置培养5天后收获 1.2HP-Sepharose一4B的制备 用层析法从人血浆中提纯的结台珠蛋白加入到 CNBr活化的Sepharose一4B中4偶联过夜偶联 率为77.14.4保存备用 1.3纯化方法 方法r:将培养液于10.000rpm.4”0离心1小时, 收上清液.调pIl至8.0,以30m1/h的流速通过经 0.OLMPB.pH8.0的缓冲液充分平衡的羟基磷灰石 柱,0.1MPB,pH70的缓冲液洗脱杂蛋白后,改用 0.tMPB,pH7.0,0.5MNaCl缓冲液洗脱FHA组分, 得FHA的粗制品将该粗制品再过t-IP—Sepharose一4B 亲和柱.收集通过{瘦,即为FHA纯制品,于0.IMPB, pH7.0.0.5MNaCI,30甘油溶液中透析平衡后,一 20保存.方法I:将培养液用33.3饱和度的硫酸铵 两次盐析.再经pBS溶液浸提.超速离心后,进行蔗糖 密度梯度离心,收集FHA组分,于0.1MPB.pH7.0? 0.5MNaCI缓冲液中透析平衡后,进行HP—Sepharose一 4B柱层析,以除去PT收集通过液,于0.1MPB, pH7.o,0.5MNaCI鲫甘油液透析平衡后一20”(2保 存. 1.4蛋白质含量测定 采用Lowry法测定”“BSA为标准蛋白 15SDS电泳 采用Laemmli法进行..FHA参考品由日本国立 预防卫生研究所Dr,YujiSato赠送 1.6FHA活性单位测定 采用FHA-ELISA法测定”“抗FHAIgG由日本 国立预防卫生研究所Dr,HirokoSato赠送 第 卷 第 一 ],展 进 学 痊 学 物 徵 \- 『,l ●f, E C 0 ～ 凸 微生物学免疫学进展1997年第25卷第2期l3 圉I方法】的层析洗脱图 Fig【E[utionpatte~ofmethod【 :ChromatographofFHAonHydr0yhpatimatrices.(Fraction3isFHA) b:ChromatographofFHAonHP—Sepharose4Baffinitymatrices(Fraction1isFHA) 图I方法I的屡析洗脱图 Fig●Elmi~npatte~ofmethodI(ChromatographofFHA onHP-Sepharose4Baffinitymatrices.FractionIis FHAj 1.7血球凝集试验 按常规方法,采用l(v/v)新鲜雄鸡红血球进 行. I.8FHA保护力试验 将FHA稀释至18vgPN/ml,以0.5ml/只的剂量 腹腔免疫NIH小鼠l0只,免疫三周后,取百日咳杆菌 18323攻毒用苗悬液脑腔攻击8万个菌.攻毒二周后t 统计小鼠存活个数,计算其保护率. 1.9FHA+PT的保护力试验 将纯化的FHA与纯化的PT以1:1的比例混合 后,稀释至18ggPN/ml,以0.5ml/只的剂量腹腔免疫 NIlt小鼠l0只.免疫三周后,取百日咳杆菌18323攻 毒用菌悬液脑腔攻击8万个苗,二周后计算保护力. 1.1OFHA被动保护力试驻 抗FHAIgG的制备:取纯制的FHA以180gg/只 的剂量背部三点皮下免疫家兔.三周启以同样剂量的 FHA进行加强免疫,三周之后颈动脉采血,分离血清, 经