南红豆杉居群的等位酶分析方法.docVIP

云南红豆杉居群的等位酶分析方法 ,ME,CAT,ACP,GDH和ADH等1O种酶系 统.由于胚乳的PER,EST,GOT,MDH,SKD5种酶系兢显示7较好的酶谱,用之进行酶 位点及等位基因分析,结果表明,5种酶系统显示714个位点,其中有两个单态位点Got一 3和Per-2,种群多态位点比率P一0.75,等位基因平均敷A=2,025.末研究揭示7云南 缸豆种群酶位点及其等位基因谱带的变异式样,为进一步种群遗传结构的研究提供7 参考资料. 关键词:主壹塾墨堑!堡量;量竺型堑,蓬1±}{恂 中图分类号:$791,495.55文献标识码:A文章编号:1001—7461(2000)04—0010—06 云南红豆杉(Taxusyum~anensi$)属红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus),为云南省级珍 稀保护植物.主要分布于滇西,滇西北横断山区及镇康,景东等海拔200043500m的沟谷与 阴坡地段.常散生于林下荫蔽处,与多种树种混生.常见的森林类型有湿润常绿阔叶林,铁杉 林,亚高山针阔混交林及云杉林.常见的半生树种是丽江铁杉,三尖杉,薄片青岗,华山橙,高山 栎,丽江云杉等’. 因红豆杉植物体内含有目前世界上最有效又最安全的抗癌药物一紫杉醇(Taxo1),因而受 到广泛重视和研究,同时也遭到大量的砍伐.云南红豆杉中紫杉醇的含量高出其它红豆杉几 倍一.使本来就比较贫乏的这一资源受到严重的砍伐和破坏.如不及时采取合理的保护措麓, 这一树种将有濒Il缶灭绝的危险.因此,了解这一树种天然居群的遗传结构和遗传变异情况,进 而制定合理而有效的保护措施已成为当务之急.等位酶分析的方法是目前了解植物居群遗传 结构和遗传变异的主要方法[11.利用等位酶技术进行植物群体遗传结构的分析在国内外已有 许多报道,还未见云南红豆杉遗传方面的研究报道. 本研究以云南红豆杉主要分布区滇西北的3个自然种群及人工林为材料,试验了叶子及 胚乳的l0种酶系统,从表现较好的胚乳的5种酶系统的14个位点中选定了酶谱清晰的l0个 收稿日期:2000-01.2O 基金项目云南省自然科学基盒项目云南红豆杉天然种群遗传多样性研究(96C128Q) 作者筒介:爵沙瑜(1968一).女,助理研究员,从事林木遗传研究工作 *王选明t尹庆t李莲芳等.红豆杉扦插育苗适用技术讲义.云南省林业科学院,1994 ??张茂钦,李选孝,左显东等.珍稀濒危树种生物学特性及内古物检测研究报告.云南省林业科学院. 199Z 第4期陈少臻等云南红豆杉居群的等位酵分析方法l】 位点及其等位基因,以便利于这些等位酶遗传标志用于云南红豆杉群体遗传结构的研究. 1材料|寅法 1.1材料 材料取自滇西北三江流域的3个自然种群,即:澜沧江流域的凤凰山林场,怒江流域的泸 水及金抄江流域的丽江及昆明树木园的人工林.以其种子的大配子体作为实验材料.各种群 的地理位置和生境详见表1. 衰1云南红豆杉4个种群的地理位置丑生境 TableIL~t[onand=nvirom’nentoftoLIrTaxuspopulstlons 8～12月种子成熟期,分单株采集种子.采回种子后,去外种皮,净粒,置低温冰箱中备用. 叶子材料取自昆明树木园的云南红豆杉种群,采集的叶子材料应尽量是同龄同部位,叶子采回 后立即制样以确保酶活性. 1.2方法 实验时,从各单株的混合种子中随机抽取6～8粒种子的胚乳以确定母株的基因型,由于 雌配子体为单倍体,可以直接用以分析是否符台Mende1分离规律,进而确定谱带所代表的等 位基因位点.同时以昆明树木园云南红豆杉人工林的同龄同部位叶子为材料,进行电泳试验. 1.2.1样品制备实验采用了3种酶提取缓冲液及2种试材,结果见袭2.每个胚乳或每 0.1g叶子用0.4mL酶提取液在冰浴中研磨提取酶蛋白,之后低温下离b(10000r/rain)10 rain,取出上清液,冷藏备用. 1.2.2凝胶及电泳采用聚丙烯酰胺凝胶不连续垂直板式电泳,分离胶浓度为7.5,浓缩 胶浓度为3%,电极缓冲液为n|窨一甘氨酸(pH8.3),电泳在4”C冰箱中进行,每样上样量为5O 皿一.电泳时,浓缩胶部分电流1mA/样,进入分离胶增至2mA/样,电泳时间3.5h左右. 1.2.3染色参照王仲仁[“,Cheliak[~]及扬一平’等人采用的方法.记录结果,照相并用干胶 仪将之橱成永久性干胶片.- 2结果及分析 实验检测了PER,EST,MDH,ME,SKD,COT,ACP,CAT,GDH及ADH10种等位酶系 统.由于叶子次生物含量高,影响其酶带分离,使酶谱严重拖尾或不清晰,加之是2倍体材料, 因而不用于遗传分析.肛乳材料试验的10种酶中PER,EST,MDH,GOT,SKD等5种酶谱带 清晰,共出现14个基因位点.以下着重对胚乳的这