大鼠颅骨成骨细胞和骨细胞的分离纯化比较研究.docVIP

精品论文 参考文献 大鼠颅骨成骨细胞和骨细胞的分离纯化比较研究 （常州市第一人民医院 江苏 常州 213000） 　　【摘要】 目的：探讨大鼠颅骨成骨细胞和骨细胞的分离纯化比较。方法：对大鼠颅骨成骨细胞和骨细胞采用序列酶消化及 EDTA 整合法进行分析纯化，并进行染色，对活性进行检测。结果：骨细胞有多个突触结构，形态比较丰满，呈现树枝状和星状，细胞之间都是通过突触相互连接的；成骨细胞呈现纤维细胞状形态和梭形细胞形态；经过Ⅰ型胶原免疫组化染色，骨细胞表达量低，为浅棕色，成骨细胞表达量高，为深棕黄色；经过BGP 免疫荧光染色，骨细胞表达高，成骨细胞表达低；经过ALP免疫组化染色，成骨细胞的ALP活性高于骨细胞，呈现棕黄色。经过ALP 活性检测，骨细胞 ALP 活性低于成骨细胞，两者比较具有统计学意义（Plt;0.05）。结论：采用序列酶消化及 EDTA 整合法可以获得纯度较高的成骨细胞和骨细胞。 　　【关键词】大鼠颅骨成骨细胞；骨细胞；分离纯化 　　【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）27-0345-02 　　在本次研究中，通过对大鼠颅骨成骨细胞和骨细胞的分离纯化进行研究，从而为骨质疏松症等骨代谢疾病的治疗机制提供帮助，具体的操作如下。 　　1.材料与方法 　　1.1 实验试剂、动物和仪器 　　实验试剂、动物：选择12只洁净条件下生长的SD大鼠，使用的实验试剂包括免疫组化染色试剂盒、ALP测定试剂盒、DAB显色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、Ⅰ型胶原酶、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原酶、骨钙素(BGP)一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗、FITC标记的免疫荧光二抗、伊红、苏木素、新生牛血清 CS(PAA)胰蛋白酶、胎牛血清FBS和alpha;-MEM培养基。 　　实验仪器：使用到的实验仪器主要包括数码凝胶图像分析仪、紫外分光光度计、台式高速冷冻离心机、电泳仪、酶标仪、电转移仪、倒置相差显微镜、二氧化碳细胞培养箱、正置荧光显微镜。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1骨细胞的分离培养 　　将骨细胞通过序列消化分离和培养传代，分离过程中消化剩余的骨碎片，将其上清液弃去，骨片采用PBS进行清洗，然后采用EDTA溶液消化骨片，弃去上清液，采用PBS进行清洗，采用Ⅰ型胶原酶进行第七次消化，将上清液收集到新的培养瓶中，加入培养基进行止酶消化，采用EDTA溶液和Ⅰ型胶原酶化进行第八次和第九次消化，将上清液收集合并。对上清液进行过滤、离心，将上清液弃去，加入alpha;-MEM 培养基，吹打然后进行计数。将浓度为3times;105个/ml的原代细胞接种到Ⅰ型胶原酶的培养皿中，放置在适宜的温度下培养，3天换一次培养基，进行胰蛋白酶细化传代。 　　1.2.2成骨细胞的分离培养 　　将乳鼠浸泡在75%的酒精中处死，在无菌的条件下取颅骨，将结缔组织和骨膜等去除，采用磷酸盐缓冲液进行清洗、把骨片剪碎，将骨片放到培养瓶中，采用胰酶进行消化，将上清液去除，然后采用Ⅱ型胶原酶进行消化，将上清液弃去，再次使用Ⅱ型胶原酶进行消化4次，收集合并上清液，加入培养基中进行止酶消化，然后进行过滤和离心，弃上清液，加入alpha;-MEM 培养基，吹打然后进行计数。将浓度为3times;105个/ml的原代细胞接种到Ⅰ型胶原酶的培养皿中，放置在适宜的温度下培养，3天换一次培养基，进行胰蛋白酶细化传代。 　　对两种细胞进行HE染色、Ⅰ型胶原的免疫组化染色、骨钙素(BGP)免疫荧光染色、ALP的偶氮偶合法染色，测定ALP活性，对两种细胞进行蛋白质印迹( Western blot) 分析。 　　1.3 统计学分析 　　两组的统计方法为：采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数plusmn;标准差(x-plusmn;s)表示，采用t检验；计数资料采用chi;2检验。Plt;0.05表示差异具有统计学意义。 　　2.结果 　　2.1 骨细胞和成骨细胞的形态学结果 　　在光学显微镜下，骨细胞有多个突触结构，形态比较丰满，呈现树枝状和星状，细胞之间都是通过突触相互连接的；成骨细胞呈现纤维细胞状形态和梭形细胞形态。两者经过HE染色之后，表现出明显的差异，骨细胞呈现放射状，成骨细胞呈现长梭形。 　　2.2 骨细胞和成骨细胞的染色结果和活性对比 　　经过Ⅰ型胶原免疫组化染色，骨细胞表达量低，为浅棕色，成骨细胞表达量高，为深棕黄色；经过BGP免疫荧光染色，骨细胞表达高，成骨细胞表达低；经过ALP免疫组化染色，成骨细胞的ALP活性高于骨细胞，呈现棕黄色。经过ALP活性检测，骨细胞ALP活性低于成骨细胞，两者比较具有统计学意义（Plt;0.05）。 　　3.讨