实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用.docVIP

精品论文 参考文献 实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用 蒋永林 　　湖南省永州市疾病预防控制中心 425000 　　【摘 要】目的：探究实时荧光定量PCR技术在流感病毒核酸检测中的应用价值。方法：选取2013年1月至2014年12月在我市采集的流感样病例咽拭子1624例用实时荧光定量PCR检测流感病毒核酸，分析检测的阳性率与阳性病例样本类型，总结流感流行趋势。结果：1624例咽拭子样本中流感病毒核酸呈阳性419例，阳性检出率为25.80%。阳性样本中甲型流感病毒H1N1亚型164例，占39.14%，甲型流感病毒H3亚型176例，占42.0%；乙型流感病毒79例，占18.85%。不同类型的流感病毒阳性检出率差异具有统计学意义（Plt;0.05）；结论：实时荧光定量PCR技术可迅速、准确的检测流感病毒核酸，有助于分析流感病毒的类型与流行趋势，为预防流感发生提供参考依据。 　　【关键词】实时荧光定量PCR；流感；病毒核酸；检测 　　流行性感冒[1-3]（简称流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，临床表现为起病急、高热、头痛伴有严重不适、干咳、咽喉疼痛等症状。流感潜伏期短，传播迅速，病毒抗原易变异，人群对变异株普遍易感。2009年甲型H1N1流感自墨西哥爆发后迅速蔓延全球，引发了人们对流感的恐慌，同时也引起了人们对预防流感的重视[4]。 　　为有效预防流感的流行，加强对流感病毒的快速检测能力，本文研究了实时荧光定量PCR技术在流感病毒核酸检测中的应用效果，现将报道如下。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　选取2013年1月至2014年12月在我市收集的流感样病例的咽拭子共1624例。所有咽拭子均是擦拭疑似流感患者的双侧咽扁桃体或咽后壁。咽拭子采集后置于含4.0ml的Hankprime;s液中，暂时于4.0℃冰箱中保存，并于24小时内送至实验室。实验室收到样本后先在旋窝震荡器上震荡5秒钟并取出拭子，编好号后置负70.0℃冰箱中保存。 　　1.2 试剂与设备 　　核酸提取试剂盒为Viral RNA/DNA Mini Kit（美国Invitrogen公司）；荧光定量检测试剂盒为：甲型流感病毒核酸测定试剂盒（荧光PCR法）、乙型流感病毒核酸测定试剂盒（荧光PCR法）、甲型H1N1流感病毒核酸测定试剂盒（荧光PCR法）、甲型流感病毒H3亚型核酸测定试剂盒（荧光PCR法）（上海之江生物科技有限公司）；荧光定量PCR仪（美国AB公司）、低温高速离心机（德国Eppendorf公司）。 　　1.3 研究方法 　　样本核酸提取按试剂盒Viral RNA/DNA Mini Kit说明书进行。PCR检测反应体系总体积为25.0ul：取检测混合液19.0ul，加酶混合液1.0ul（内含逆转录酶和Taq酶），最后加入5.0ul待测样本核酸提取液，震荡混匀并短暂离心后上机检测。PCR反应条件为：45.0℃，10min，95.0℃，15min；95.0℃，15sec，60.0℃，1min，共40个循环，单点荧光检测在60.0℃时进行。 　　1.4 观察指标 　　统计采用实时荧光定量PCR技术检测流感病毒的阳性率，并分析阳性样本的类型。 　　1.5 统计学方法 　　采用SPSS18.0统计学分析软件进行数据处理，计数资料采用百分数表示，组间比较采用chi;2检验，以Plt;0.05作为差异具有统计学意义的标准。 　　2 结果 　　2.1 PCR检测结果分析 　　表1 流感病毒核酸PCR检测结果 　　本研究采集的1624例咽拭子样本经实时荧光定量PCR技术检测后共证实流感病毒核酸呈阳性419例，阳性检出率为25.80%。阳性样本中甲型流感病毒H1N1亚型164例，占39.14%；甲型流感病毒H3亚型176例，占42.0%；乙型流感病毒79例，占18.85%。不同类型的流感病毒阳性检出率差异具有统计学意义（Plt;0.05）。详见表1。 　　3 讨论 　　流行性感冒是急性呼吸系统常见疾病，主要是由流感病毒引起的，具有感染性强、潜伏期短、病情发展迅速等特点，患者临床表现多为高热、乏力、呼吸系统疾病症状等，严重威胁人类生命健康[7，8]。相关研究表明[9]，流感病毒致病率高，而且随着药物广泛治疗，病毒的变异性逐渐提高。为了降低发生大范围的流感病毒感染的风险，必须加强对流感病毒的预防[10]。实时荧光PCR检测技术是利用PCR反应体系中加入荧光基因，并利用荧光信号实时积累并监测整个PCR反应进程，最后利用标准曲线对检测目标物进行定量分析，是临床上用于病毒核酸定量检测的常用方法。因此，笔者研究采用实时荧光定量PCR检测流感病毒核酸的应用效果，旨在为临床应用提供参考。 　　本研究通过对1624例疑似流感患者咽拭子样本进行实时荧光定量PCR技术