Lipocalin文库的构建及与克百威有结合活性的小分子筛选.pdfVIP

V01．29 高等学校化学学报 No．3 2008年3月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 528—532 Lipocalin文库的构建及与克百威有 结合活性的小分子筛选 武婕1”，杨金易1，张宏斌2，潘科1，王弘1，雷红涛1，郑 霖1，肖治理1，孙远明1 (1．广东省高等学校食品质量安全重点实验室，华南农业大学食品质量与安全研究所，广州510640； 2．广州军区广州总医院医学试验科，广州510010) 摘要构建大菜粉蝶Lipocalin蛋白家族中的BBP蛋白突变文库，依据基因序列，分别设计10条和12条引 物，通过PER重叠延伸法得到包含随机突变蛋白BBP的基因序列，并重组到噬菌粒载体pCANTAB5E中构 皿式交叉法对Lipoealin文库进行了筛选，用竞争洗脱法洗脱特异结合活性的噬菌体．经过3轮筛选，从第3 anticalin分子能与克百威特异结合．为 轮的洗脱液中随机挑选了10个重组克隆，用Dot-blotting法检测出K7 用奠定了基础． 关键词Lipocalin文库；克百威；Antiealin分子 中图分类号Q514 文献标识码A 文章编号0251-0790(2008)03-0528-05 Lipocalin是一类广泛存在于生物界，从细菌到人类都存在的一类蛋白家族，具有运输或贮存低溶 解度物质和化学敏感性物质如维生素、类固醇类激素、芳香素、信息素和多种二级代谢产物的功 能‘1，2 家族却有高度保守的三级结构：即由8个反向卢转角形成的届桶状结构(结合配体的核心区域)和c端 配体的特异结合活性，4 J．基于Lipoealin蛋白家族与抗体具有类似的高级结构特征(由保守区和超变 区组成)，可以构建如抗体库一样的Lipoealin文库，使其成为一个研究小分子有机物的技术平台． 克百威是一种毒性大和危害重的小分子有机物，常作为农作物的杀虫剂使用，有效地检测出克百 威的残留量是关系到人类身体健康的大事．国际上通用的检测小分子有害物的方法是基于抗原抗体特 异结合反应建立的免疫分析法∞j，但是小分子有害物分子量小，有毒，使制备相应的抗体有一定难度， 所以已开发出来的小分子有机物检测试剂盒很有限∞J．虽然可以从噬菌体表面展示抗体库中筛选克百 威等小分子的重组抗体，但抗体主要与体内大分子特异性结合，使得很难筛选到与小分子有机物亲和 性很高的重组抗体．因此，有必要探索其它途径，获得与克百威亲和性很高的抗体类似物． 提供了有效的手段．Skerra等。卜纠以BBP蛋白的保守区为骨架蛋白，在超变区部分随机引入突变蛋白 收稿日期：2007-06·18． 2006资助． 联系人简介：孙远明，男，教授，博士生导师，主要从事食品质量与安全方面的研究．E-mail：ynmun@＆3a11．edu．ca 武婕等：Lipocalin文库的构建及与克百威有结合活性的小分子筛选 529 考虑构建BBP的Lipocalin文库，并将其应用到与人类生活密切相关的食品安全检测等方面，为开辟文 库的又一崭新应用提供理论基础．本文构建了以大菜粉蝶Lipocalin蛋白家族中的BBP蛋白为骨架蛋 高效的Anticalin类检测试剂盒奠定了实验基础． 1实验部分 1．1试剂与仪器 限制性内切酶BstXI，XbaI购自美国NEB公司；T4DNA连接酶、碱性去磷酸酶Alkaline Phospha— HSDNA tase(CIAP)和PrimeSTAR 4Fast HRP．抗M13噬菌体抗体和NHS．活化的快速葡聚糖4(NHS—activatedSepharoseFlow)购自Amer- sham