实验三 细胞的化学成分2.pptVIP

实验三 细胞主要化学成分的检测 细胞的化学成分 细胞的组成：无机物和有机物，有机物主要是四类生物大分子： 多糖 脂肪（脂质、膜） 蛋白质 核酸 实验目的 1、掌握生物大分子在细胞内的存在部位； 2、学习细胞内主要化学成分的检测方法； 3、掌握徒手切片的制片方法，掌握细胞内不同生物大分子使用不同的染色剂。 实验用品 1、器材：显微镜，恒温水浴锅，温度计，刀片，小烧杯，剪刀，镊子，吸管，玻片，染色缸，解剖器械，吸水纸 2、试剂：浓盐酸，碱性品红，偏重亚硫酸钠，活性炭，三氯乙酸，氯化钠，联苯胺，双氧水，硫酸铜，番红，乙醇，甲基绿，派洛宁，高碘酸 3、材料：马铃薯，洋葱，小白鼠 细胞内多糖的检测 1、细胞中多糖的测定（高碘酸-希夫反应 PAS）： 糖类是生物有机体生命活动能量的主要来源。高碘酸希夫试剂反应，简称PAS反应。PAS反应是利用高碘酸作为强氧化剂，这种强氧化剂能把葡萄糖分子中2-3碳原子之间连接的键打开，使多糖分子中的乙二醇变成乙二醛，氧化所得到的醛基与Schiff试剂反应形成紫红色化合物。颜色的深浅与糖类的多少有关。 细胞内多糖的检测 （1）切片：把马铃薯块茎用单面单片徒手切成薄片，取一薄片放在培养皿中； （2）氧化：加高碘酸溶液将薄片浸没氧化5-15min； （3）固定：染色完后将材料移入70%乙醇中浸5min； （4）染色：用Schiff试剂染色15-20min； （5）亚硫酸溶液洗：染色完后用新配制的亚硫酸溶液洗3次，每次1min； （6）蒸馏水冲洗：用蒸馏水冲洗1-2次； （7）装片镜检：将材料转移到载玻片上，盖上盖玻片，置于低倍镜下观察，细胞壁、淀粉粒呈紫红色。 细胞内过氧化物酶的检测 2. 细胞中过氧化物酶的显示——联苯胺反应 在生物体内，细胞代谢过程会产生对机体有害的过氧化氢。存在于动植物组织中的过氧化氢酶能使过氧化氢分解，生成水放出氧气，对机体起到保护作用。过氧化氢酶系能把许多胺类氧化为有色化合物。若用联苯胺混合液处理标本，细胞内的过氧化氢酶能把联苯胺氧化为蓝色或棕色产物。 临床意义：定性研究、定位观察急性白血病及其鉴别诊断。 细胞内过氧化氢酶的检测 （1） 用颈椎脱臼法处死小白鼠，剪开大腿上的皮肤和肌肉，取出股骨； （2） 剪断或者折断股骨，用牙签挑取骨髓（或注射器针头吹） ，涂布于载玻片上制成涂片，晾干； （3） 向涂片上滴加几滴0.5%CuSO4，固定1min； （4） 倾去CuSO4溶液，滴加0.1%联苯胺混合液，染色6min； （5） 用自来水或蒸馏水冲洗材料，滴加1%番红染液，染色1min； （6）用自来水或蒸馏水冲洗材料，空气中晾干，显微镜下观察。骨髓细胞内可见到蓝色或者棕色的颗粒，即为过氧化物酶所在的部位。 细胞内DNA的检测 3.DNA的细胞化学——Feulgen反应 DNA是由许多单核苷酸聚合成的多核苷酸，每个单核苷酸又由磷酸、脱氧核糖和碱基构成。DNA经1mol/L HCl水解，除去RNA，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应。Schiff试剂是碱性品红和偏重亚硫酸钠作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合则形成紫红色的化合物。因此凡是有DNA的地方，都能显示紫红色。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。材料不经过水解或预热的三氯乙酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。 此反应不仅可定性地观察DNA存在的部位，还可以定量地进行分析。 细胞内DNA的检测 （1）将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在盛有1mol/L HCl的小烧杯中，在60℃中水解8-10min； （2）用蒸馏水水洗，洗去材料表面的酸液； （3）用Schiff试剂遮光染色30min； （4）用新配制的亚硫酸水溶液将材料洗3次，每次1min； （5）用自来水或蒸馏水冲洗5次； （6）将根尖放在载玻片上，用镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。 （7）显微镜检查，细胞中凡是有DNA分布的部位应呈现紫红色的阳性反应。 细胞内DNA的检测 对照片 方法一：先将材料放在5%三氯乙酸中90℃水浴15min，主要把DNA抽提掉，然后按照步骤（1）—（7）制片观察。 方法二：材料不经过1mol/L HCl水解，直接放在Schiff试剂遮光染色，然后按照步骤（4）—（7）制片观察。