胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅳ基因3′端的克隆、原核表达及单克隆抗体的制备研究.pdf

2004学术年会囝745 计基于表位的安全有效的疫苗以及开发基于表位的诊断试剂有重要意义。尽管抗原物质的B细胞表 位通常大部分是构象表位，仅有一小部分为线性表位。本实验中多表位融合蛋白与SARS康复血清 以及免疫鸡血清的免疫印迹结果表明所预测的表位中含有真实的表位。并且利用单克隆抗体进一步 鉴定出了抗原表位s2和s5，它们均为线性表位。表位s2能被SARS康复血清的免疫鸡血清识别， 表明两种血清中均有表位s2特异的抗体，也提示表位s2是暴露在s蛋白表面。表位S2的核心序 片段是与SARS．CoV受体ACE2结合的部分，表位s2正好位于该受体结合结构域中。 SARS—CoV是一种新出现的冠状病毒，从最先发现分离此病毒至今，世界各国的科研人员已测 定了数十株病毒的全基因组序列。在病毒的病源学，免疫及病毒大分子结构与功能的研究上均取得 了重要进展。但是SARS是一种新出现的传染病，要完全控制该病还有许多研究工作要做。本研究 对SARS．CoV S蛋白抗原表位进行了初步分析，构建并表达了多表位重组融合蛋白，制备了抗s蛋 白单克隆抗体，鉴定了两个S蛋白抗原表位，为进一步分析s蛋白结构与功能以及对抗SARS疫苗 的设计提供了一定的基础。 参考文献(略) 胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅳ基因3’一端的克隆、 原核表达及单克隆抗体的制备 黄红亮，陈焕春，陈美玲，贝为成，严琳 华中农业大学动物医学院动物病毒室，武汉湖北430070 摘要：本研究参照胸膜肺炎放线杆菌血清l利lapxlVA基因序列合成两条特异性引物，从本实验 鼠，取免疫鼠脾细胞与SP2／0融合，经筛选、克隆后获得5株稳定分泌抗ApxI、℃单克隆抗体的杂交瘤 细胞，为研究ApxIV的作用机制提供了特异性的试剂。 关键词：胸膜肺炎放线杆茵；毒素Iv；克隆与表达；单克隆抗体 猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus 的一种猪的呼吸道疾病，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。目前，发现APP有15个血清型， 各血清型之间交叉反应弱，各个国家和地区流行的优势血清型各不相同，从而导致该病的控制相当 困难。 尽管胸膜肺炎放线杆菌的毒力与外毒素，荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、脲酶、转铁蛋白等相 关，但外毒素是胸膜肺炎放线杆菌的主要毒力因子。胸膜肺炎放线杆菌可产生4种外毒素，即毒素 I、II、IⅡ、IV(APX I具有强溶 I、II、IⅡ、IV)，4种毒素均属于RTX家族。研究发现，Apx 弱，由血清型10、14以外的所有血清型产生；ApxlII则无溶血活性，只有强细胞毒性，由血清型2、 3、4、6、8、15产生。ApxⅣ为最近发现的外毒素，具有弱溶血活性和共溶血效应。与其它三种毒 的革兰氏阴性细菌不带有该基因，是一个种属特异性基因。apxlV基因的另一特点为该基因只能在 动物机体内被诱导表达，在目前的培养条件下，体外培养时无论菌体或培养上清种都检测不到该毒 素，是第一个体内诱导表达的外毒素基因，因而要得到天然的蛋白对其进行研究极其困难。目前人 们对ApxlV对胸膜肺炎放线杆菌的的作用及在机体内的作用机制仍不清楚。 鉴于以上原因，本研究用分子生物学技术获得了重组蛋白ApxlVAC，并用重组蛋白免疫Balb／c 鼠，制备了抗ApxIVAC的单克隆抗体，将有助于阐明ApxlV的作用机理。 1材料与方法 1．1材料 胸膜肺炎放线杆菌(XT04)由本实验室分离鉴定，为血清2型；E．coli DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自大连TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有 Associates公司；血清1型标准阳性血 Biotechnology 限公司；Anti．porcineIgG-HRP嫩J自美国Soutllem 因序列(AF021919)设计合成(上海生工生物工程有限公司)的特异性引物，上游引物序列为： 1．2方法 1．2．1表达载体的构建 ×Buffer 4 MdNTPs2