鸡α干扰素基因的克隆表达与禽流感病毒H5N1的作用.pdfVIP

兽医部分 643 鸡0【干扰素基因的克隆表达与禽流感病毒(H5N，)的作用。 吴艳花卅 张国中1 韩春来1’2 韩 雪1 李绍勇1 汪 明1— 100094 (1．中国农业大学动物医学院北京 2．北京市兽医卫生监督所) sephawse4B 亲和层析柱对重组蛋白进行了纯化。重组删一a的抗病毒活性为3．16×1旷W／w．g。试验表明，纯化的重组蛋白在细胞 达到100％。 关键词：鸡；禽流感；chlFN—at；克隆；表达；抗病毒活性。 干扰素是一类重要的细胞因子，是由生物体细胞受病毒或其他诱生剂作用而产生的分泌性糖蛋白， 具有抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫等多种生物学活性。a一干扰素具有广谱的抗病毒作用。Sekellick ChIFN—a对H9N2型禽流感有抑制作用bJ。 胚上的实验表明：ChIFN—a对H5Nl型禽流感病毒有抑制作用。 1材料与方法 1．1材料 惠阳胡须鸡购自中国农科院畜牧兽医所；SPF鸡胚购自北京维通利华实验动物有限公司；水泡性口炎 病毒(vsv)和H5N。禽流感病毒、E．coli To,／PCR试剂盒、连接试剂盒、内切酶Sa／I、EcoRI均为TaKaRa产品，购自宝(大连)生物技术公司；玻璃 奶纯化回收试剂盒为博大泰克生物公司产品。 1．2 ChlFN—oc的克隆及鉴定 ttc aac 为5’一ctt cacctt cta t一3’。PCR反应以 tgc gtc agt gaa cgcC一3’，下游引物为5’一caggac gcgcgtgttgcc oc 肝脏总DNA为模板，反应条件：98℃5rain；94℃lmin，58 I和Sa／I进行双酶切鉴定。 PcR产物与pI：EXT一6p一1载体连接，重组质粒用EcoR 1．3 ChIFN—oc的诱导表达及抗病毒活性测定 将鉴定为阳性的质粒转化大肠杆菌B121，进行WIG诱导表达，经SDS—PAGE和Westernblot鉴定正 确后，大量表达，然后用Glutathione—sepharose4B亲和层析柱纯化。应用细胞病变抑制法在CEF／VSV细胞 ·基金项目：国家“十五”攻关项目(2004BASl4A14—6)。 -¨通讯作者：汪明电话：010E—mail：vetdⅢ@咖．edu．∞。 系检测干扰素抗病毒活性，将抑制50％细胞病变出现孔最大稀释度的干扰素定义为1个干扰素活性单位 (U)。 1．4 ChlFN—13c在细胞水平上对禽流感的抗病毒作用 收获病毒测HA效价。 1．5 ChlFN—oc在鸡胚上对禽流感的抗病毒作用 病毒，继续培养15h收获接种胚尿囊液，进行HA检测。 2结果 2．1 ChIFN—o[的克隆及鉴定 I和SM PCR产物大小约为492bp，与预期大小一致，参见图lA。用EcoRI双酶切后插入pGEXT一 6p一1载体，构建了重组质粒pCEXT一6p一1／ChIFN—a，酶切鉴定结果与预期结果一致，见图lB。 图1 ChIFN—a的PCR扩增及酶切鉴定结果 marker A：Lane1．PER lane2．D12(II)DNAB：Lane1．ChIFN—arecombinantbefore products pl羽mids enzymedigestion digestion ofrecombinantL