谷氨酰胺化学降解及其对杂交瘤细胞培养的影响.pdfVIP

谷氨酰胺化学降解及其对杂交瘤细胞培养的影响 辛艳，杨艳，李强，曹竹安 (清华大学化学工程系，北京，100084) 捕要 奉文研究了谷氨酰胺在贮存和培养条件下的化学降解规律，拟舍得到算降解一级反应速率 hr‘和00032 常微分别为O．0009 ht‘。1．并用杂交瘤细胞C50进行了不同谷氨酰胺浓度下的批次培养． 探讨扣除谷氧酰胺化学降解部分后．其在细胞培养过程中的实际代谢规律．结果表明，当初始浓度 低于5mM时，谷氨酰胺的利用丰大于80％，且初始浓度越低，利用率越高：随着初始浓度的升高， 谷氧酰胺利用率逐渐降低，当大干10mM后，利用率急剧降低．这一工作为培养基贮存厦优化培养 襄略提供了一定的依据． 关蕞词 谷氨酰胺 化学降解杂交瘤细胞 谷氨酰胺是动物细胞培养中一种很特殊的必需氨基酸，常用培养基中其浓度在O．7．5mM之 间。它既可作为细胞生长的主要能源．又可以作为氮源，不但是合成嘌呤、嘧啶的前体，而且参 与合成蛋白质和多肽。但谷氪酰胺的水解又是培养体系中主要毒性副产物氨的重要来源，在培养 化学降解．生成氨和吡咯烷酮羧酸，这是个一级反应，其反应常数和温度、酸碱度、血清浓度有 关：(2)披谷氨酰胺酶所水解，生成氨和谷氨酸。在批式培养中，一部分谷氨酰胺被细胞作为能 源消耗进入三羧酸循环，生成两分子氨，而参与生物量合成的谷氨酰胺并不产生游离的氨。因此， 研究谷氨酰胺的化学降解规律及其在不同谷氨酰胺浓度的批次培养中对杂交瘤细胞生长的影响． 对于设计最佳的谷氨酰胺给料浓度和方式．咀减少氨的积累．具有重要意义。 1材料与方法 1．1细胞系、培养基及培养条件 胎牛血清7％(天津川I页)。谷氨酰胺预先配成高浓度溶液，实验时加入培养体系中，并注意使加 入体积小于体系总体积的5％。实验在方瓶中进行，环境为370c，5％CO：，每批2个平行样，并 傲平行空白样。空白样的所有操作与样品相同．只是不接入细胞。 1．2分析方法 葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺的浓度均由SBA-40C型生物传感分析仪(山东省科学院生物研究 Blue染色排除法。 所)直接测定，氨浓度用靛酚蓝比色法测定，细胞计数采用Trypan 2结果和讨论 2．1谷氨酰胺化学降解实验 为考察贮存和培养条件下谷氨酰胺的化学降解速率，进行了这两种条件下的空白实验。图l 描述了贮存(40C)和培养条件下的化学降解曲线。文献报道谷氮酰胺化学降解符合一级动力学， 下．k为O．0009 hr1略小于文献值(Glaken等【1】测 hr-t．t。n约为32天；培养条件下，k为0．0032 得值为O．0048 hr1)，tIn约为9天。 2．2谷氨酰胺浓度梯度实验 常用培养基中谷氨酰胺的浓度为0．7．5raM．为考察其化学降解对细胞培养的影响，进行了低 6lO 影响，葡萄糖采用了足够高的浓度20mM． 2．2．1细胞生长曲线 图1谷氨酰胺化学降解曲线 图2细胞生长曲线 图2是低浓度下典型的批次培养实验的谷氨酰胺代谢曲线(含空白)和细胞生长 曲线．从图中可以看到，谷氨酰胺的耗尽后约8小时细胞达到最大密度，随后即开始死亡。啦前 的实验证实，常规谷氨酰胺浓度下．批次培养结束时，各种氨基酸都有大量富余，这说明低浓度 下．谷氨酰胺的耗尽是细胞开始死亡的直接原因，只是有一定的滞后期．Higareda等12】也观察到 同样的现象。 2．2．2谷氨酰胺化学降解的影响 由于培养液中谷氨酰胺浓度的降低除了归因于细胞消耗外，化学降解也占了相当一部分，因 此，考察不同浓度下化学降解所占的比例，进而求出细胞对谷氨酰胺的实际利用情况，对进一步 理解细胞的代谢规律和设计培养策略具有重要意义。 实际被细胞所利用的谷氨酰胺C。d。的消耗速率可表示为下式的形式： —d．—C—：：—d—．C．—c—et—t—．kC dl dl ·-。一一 其中，C为体系中实际的谷氨酰胺浓