蛋白酶活性的测定方法及原理.pptxVIP

蛋白酶活性的测定方法及原理 罗老师 组员 宁舒婷 陈丽君 陈海梅 王熙栋 各种测定方法及原理 考马斯亮蓝法 甲醛滴定法 DHT-酪蛋白法 DNA-溴乙锭荧光分析法 X-光胶片法 福林酚法 甲醛滴定法 3 考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合，主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 考马斯亮蓝法 4 蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸，从而测定其酶活。 考马斯亮蓝法 甲醛滴定法 5 用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价离子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法可测定蛋白酶酶活。 考马斯亮蓝法 DHT-酪蛋白法 6 溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时，可使DNA的荧光增加25倍。接近饱和的溴乙锭(0.5µg/mL) 与DNA 混合时，其荧光增加量与DNA的浓度呈正比。在DNA-组蛋白-溴乙锭溶液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在DNA链上的组蛋白，使DNA 结合部位暴露出来，溴乙锭重新插入DNA双链中，荧光增加量与蛋白酶活性呈正比。通过测定DNA溶液的荧光增量来计算蛋白酶的活性。 考马斯亮蓝法 DNA-溴乙锭荧光分析法 7 酶的底物明胶涂抹在X-光胶片上，当待测酶液滴加到X-光胶片上时，酶将X-光胶片上的明胶水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被酶水解的地方，出现透明的圆圈。酶活性的高低与透明圆圈的面积成正比。测定圆圈的面积以测定蛋白酶的活性。。 考马斯亮蓝法 X-光胶片法 8 福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物，而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理测定蛋白酶酶活。 考马斯亮蓝法 福林酚法 福林酚法测定蛋白酶活性 蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。 分析天平：精度0.0001g 恒温水浴：精度±0.2℃ 计时表 分光光度计 沸水浴器 振荡混合器 pH计: 精度0.01pH单位 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶 磷酸缓冲液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶 硼酸缓冲液 (pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶 0.4mol/L碳酸钠溶液 0.4mol/L的三氯醋酸液 0.5mol/L的NaOH 10.00mg/ml酪素溶液 100μg/ml酪氨酸标准溶液 标准曲线的绘制 试管0 试管1 试管2 试管3 试管4 试管5 100μg/ml酪氨溶液（ ml ） O 1 2 3 4 5 蒸馏水（ ml ） 10 9 8 7 6 5 酪氨酸实际浓度 （μg/ml ） O 10 20 30 40 50 L-酪氨酸标准溶液按下表配制 分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值，其K值应在95~100范围内。 实验步骤 蛋白酶活性的计算 K：吸光常数 Title 1g固体酶粉（或1ml液体酶），在40℃（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、碱性pH=10.5）条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位。 蛋白酶的活力= A×K×4/10×n U/g(ml) A：样品平行试验的平均OD值 K：吸光常数 4：反应试剂的总体积 0：酶解反应时间 n：酶液稀释总倍数 1 思考题 Title 蛋白酶有哪几类？ ①按蛋白酶水解蛋白质的方式：A内肽酶：切开蛋白质分子内部肽键，生成相对分子质量较小的多肽类；B外肽酶：切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸的