北京大学色谱课件LC-3.pptVIP

The strength of the binding depends on: buffer system, pH value of the buffer which determines the surface charge of the protein concentration of the counter ions, charge density on the support. 固定相的选择 保留时间 孔径太小 孔径太大 选择性渗透 总排阻 总渗透 孔径合适 校准 - 测定分子量 2,610,000 111,000 39,000 19,500 15,300 10,900 1,500 65 分子量（MW）: 保留时间 (min) 保留时间 (min) V z V p V Z V p V M 色谱柱流动相体积 隙间体积 固定相孔体积 聚合物洗脱体积 V e GPC K 聚合物可接触体积 Log(MW *黏度) GPC 计算 ? ? Area i (Area / M ) i i M = n 数均分子量 (Area x M ) i i ? ? Area i M = w 重均分子量 ? ? Area i M = v (Area x M ) i i h 1/h 黏均分子量 (Area x M ) i i ? ? M = z (Area x M ) i i 2 Z-均分子量 D = M / M w n 多分散性 i (Area / Slope ) i W = i Area / Slope i i ? 分子量分布 Area=峰面积 固定相的选择 分子量对数 体积 (ml) 线性范围 10 104 105 106 107 108 102 103 100 ? 500 ? 1000 ? 10,000 ? 100,000 ? 1,000,000 ? MW 基于孔径选择固定相 (?) 混合柱床将有较大 的线性范围. 优化 GPC 分离度 选择性 柱效 R = 1/4 N x - 1 容量因子 x k 1 + k 分离度方程: X X 在固定相上 无保留 没有分配作用， 但选择合适的孔 径能够影响选择性 降低流速 增加柱长 SEC优化提示 大的进样体积将导致分离度降低. 保持进样体积为峰体积的5-10%. 0.5% 的流速变化会引起 0.7% 的分子量变化. 温度变化1oC 引起分子量变化 0.1%. 分析在两个柱体积内完成. 被分析物的黏度不应大于溶剂黏度的2倍. 分离性能随流速降低而提高 (也可防止大分子量聚合物的偏差). 可能需要多根色谱柱, 尽可能减小连接管死体积. 要实现化合物之间的完全分离, 其分子量起码应相差 10%. GPC 仪器要求 硬件 精确的泵流速 保留时间精密度 0.1.% 在线脱气 用预热溶剂恒温是色谱柱 检测器具有最低的短期和长期噪声 (波动) 系统具有高的长期重现性 耐用的自动进样器 软件 在日常工作中容易使用 与标准HPLC软件组合在一起 符合 GPC 标准, 如 ISO/EN/DIN 各种校准方法 自动的和交互的数据分析和报告 用户化报告 (质量百分比, 分子量分布, 曲线, 校准结果) 1. 请预测这些邻苯二甲酸酯在正相色谱柱上的洗脱顺序? 邻苯二甲酸二丁酯 邻苯二甲酸二甲酯 邻苯二甲酸二壬酯 邻苯二甲酸二乙酯 5% 四氢呋喃 95% 异辛烷 作业 2. 如果将流动相改为5%甲苯和95%异辛烷，请预测色谱图会有何变化? 作业 简单叙述GC和HPLC分离中流动相所起的作用有何不同。 反相HPLC分离甲苯、硝基苯、氯苯和苯，请预测出峰顺序，并简述理由。 请列出色谱峰定性鉴定的主要方法（3种） 是否可用HPLC分析天然气的组成？ 为什么？ In normal phase, sample retention is controlled by adsorption to the stationary phase. A sample molecule must displace solvent molecules from the surface. In addition to displacement, sample molecules can have strong interactions with particular sites on the stationary phase. Localization. Separation is based upon attraction between polar sites on the stationary phase and polar functionalities